一种提高生产2-KLG发酵产量的葡萄糖酸杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一种提高生产2-KLG发酵产量的葡萄糖酸杆菌及其应用，通过基因工程技术，将来源于G.oxydans的pqqA及pqqABCDE基因，分别表达于本实验室构建的由山梨醇生产2-KLG的G.oxydans一步工程菌中，解除小菌对伴生菌依赖的问题，实现了从D-山梨醇到2-KLG的直接转化，简化了维生素C生产工艺，为了进一步提高2-KLG的产量，将PQQ合成的关键基因pqqA及基因簇pqqABCDE分别表达于G.oxydans一步工程菌中，2-KLG的产量最高可达51.8g/L，较未表达PQQ的一步工程菌提高了60％。

主权项

一种提高2‑KLG发酵产量的葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)工程菌，其特征在于将pqqABCDE，或pqqA及pqqABCDE同时表达于G. oxydans一步工程菌中，所述G. oxydans一步菌中表达质粒pGUC‑tufB‑sdh‑GS‑sndh，工程菌的构建过程如下：对K. vulgare WSH‑001的全基因组测序结果中注释的sdh及sndh通过连接肽GGGGS融合后连接到pMD19‑T测序，同时将来源于G. oxydans的强启动子tufB进行扩增连接到克隆载体pMD19‑T测序，获得正确的转化子后进行双酶切连接到E.coli‑G.oxydans穿梭质粒载体pGUC1，得到重组质粒载体pGUC‑tufB‑sdh‑GS‑sndh；再将K. vulgare WSH‑001的全基因组测序结果中注释的pqqA及pqqABCDE，分别获得基因，连接到克隆载体pMD19‑T测序，获得正确的转化子后进行双酶切连接到质粒pGUC‑tufB‑sdh‑GS‑sndh上，构建得到pGUC‑tufB‑sdh‑GS‑sndh‑pqqA、pGUC‑tufB‑sdh‑GS₂‑sndh‑pqqABCDE，将构建好的重组表达载体转化E.coli JM109，菌落PCR验证阳性转化子；再将来源于G. oxydans WSH‑003的tufB启动子序列扩增后克隆到pMD19‑T测序，获得正确的转化子后双酶切连接到pGUC‑tufB‑sdh‑GS‑sndh‑pqqA、pGUC‑tufB‑sdh‑GS₂‑sndh‑pqqABCDE，构建得到pGUC‑tufB‑sdh‑GS‑sndh‑tufB‑pqqA、pGUC‑tufB‑sdh‑GS₂‑sndh‑tufB‑pqqABCDE，转化E.coli JM109后菌落PCR验证阳性转化子，再通过三亲本杂交的方法将重组表达载体转移至G. oxydans WSH‑003中；所述pqqA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1，所述pqqABCDE基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。