基于质谱技术的布鲁氏菌快速检测试剂盒

摘要

本发明提供一种快速检测血液样本中布鲁氏菌的试剂盒，涉及蛋白质指纹图谱检测技术领域。本发明基于质谱技术，构建了针对血液中布鲁氏菌检测的特异性多肽质谱模型，以及使用质谱技术进行布鲁氏菌检测的试剂盒。本发明试剂盒能够通过特异性指纹图谱鉴定血液样本中的布鲁氏菌，准确度高、重复性好，2小时内可完成96个样本的检测，比传统检测方法至少提前5天完成检测，且检测成本低廉，结果可靠，具有良好的应用前景。

主权项

一种检测布鲁氏菌(Brucella)特征蛋白的质谱模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将在培养基上培养至对数生长期的布鲁氏菌标准菌株接种于培养瓶中，使菌浓度达到10¹⁰CFU/ml，依次稀释7个数量级至10³CFU/ml，37℃培养,0天、2天、4天、10天、15天；同时设阴性对照；布鲁氏菌接种的培养瓶中，培养基为血液，使用麦氏比浊管测定菌血浓度，所述的培养瓶为双向血液培养瓶；2)每一取样时段，取上述8个数量级的菌液样本，采用乙醇/甲酸法进行质谱前预处理，制备蛋白样品；3)将上述8个数量级的菌液、在5个时间段的40个蛋白样品以及阴性对照血液样品处理得到的蛋白分别上质谱仪样品靶，设定参数对蛋白质指纹图谱进行标准化处理；采集2000‑20000Da范围内的肽图谱；对所得数据进行统计学处理，得到具有统计学意义的布鲁氏菌8个特征蛋白，其质荷比分别为：3782.9、4338.6、4539.6、5025.1、5045.2、5292.3、7395.6、9077.9，将上述8个特征蛋白作为检测布鲁氏菌特征蛋白的质谱模型；其中，步骤3)中，将蛋白样品上质谱仪样品靶，样品干燥后，覆盖基质，所述基质为α‑氢基‑4‑羟基肉桂酸在50％乙腈、2.5％三氟乙酸中的饱和液；并且，步骤3)中质谱仪为MALDI‑TOF质谱仪，氮激光器波长377nm,质量采集范围2000至20000Da，源1电压,20kV,源2电压,18.5kV,透镜电压,8.45kV；延时提取,320ns；激光频率20Hz，调整总采集频次使谱图总强度大于10000；每次数据采集前，采用大肠杆菌ATCC8739质控校正仪器，使分子量误差<0.02％。