特异性鉴别羊乳中掺加牛乳的单克隆抗体及其制备方法

摘要

本发明涉及特异性鉴别羊乳中掺加牛乳的单克隆抗体及其制备方法。市场上常出现羊乳中掺加牛乳的现象，以次充好，影响羊乳质量。本发明以脱脂牛乳为抗原，免疫BALB/c小鼠，分离脾细胞与SP2/0瘤细胞进行细胞融合，筛选出具有稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，所获单克隆抗体能够特异性识别牛乳中的非乳清抗原，且与羊乳不存在交叉反应。本发明识别牛乳的最低限度为0.2%，可用于开发检测试纸条，检测试剂盒等，为开发羊乳中掺加牛乳检测试剂盒等检测产品奠定基础。

主权项

特异性鉴别羊乳中掺加牛乳的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：制备免疫抗原：取新鲜牛乳置于4℃离心机，4000~6000rpm，10~20min离心；牛乳分层，上层主要为脂肪，完全弃去，保留并充分混匀剩余部分，即为脱脂乳，作为免疫抗原；步骤二：免疫：取6‑8周龄雌性BALB/c小鼠，利用免疫抗原免疫4次，免疫结束三天后进行细胞融合；步骤三：制备杂交瘤细胞：细胞融合前一天，制备饲养层细胞；细胞融合于无菌条件下进行，将分离的脾细胞与SP2/0瘤细胞按（5‑10）：1的比例混合，在PEG1500的作用下进行细胞融合，将融合后的杂交瘤细胞铺于含有饲养层细胞的96孔细胞培养板中，置于37℃，5% CO₂培养箱中培养；步骤四：筛选杂交瘤细胞：按照常规间接ELISA检测杂交瘤细胞培养上清：分别用鲜牛乳、鲜羊乳、牛乳清作为包被抗原，200ul/孔，包被后，4℃过夜， PBST洗涤3遍，加入细胞培养上清，以阴性小鼠血清作为阴性对照，100ul/孔，每个稀释度做3个重复，37℃孵育1~2h，PBST洗涤3遍，加入辣根过氧化物酶标记的抗体，1:5000稀释，100ul/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3遍，加入TMB显色液，37℃孵育20min，加入终止液，置于酶标仪检测各孔OD₄₅₀值，以S/P>2.1为阳性判断标准，标记并筛选含有阳性杂交瘤细胞的细胞培养孔；将筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行单克隆化培养，单克隆化培养采用有限稀释法：首先，进行细胞计数，根据细胞计数结果，对细胞悬液进行稀释；取230个活细胞悬浮于4.6ml的RPMI1640培养基中，此时，平均每0.1ml溶液含有5个细胞，接种于96孔板，每孔0.1ml，共36孔；剩余1ml，再加4mlRPMI1640培养基，共5ml，此时，平均每0.1ml溶液含1个细胞，接种于其次的36孔，每孔0.1ml；最后剩余1.4ml，再补加1.4ml，共2.4ml，接种于剩余24孔，每孔0.1ml，此时每孔0.5个细胞；铺板结束后，置于显微镜下，标记出只含有一个细胞的细胞培养孔；得到的杂交瘤细胞稳定分泌单克隆抗体，能够特异性识别牛乳中的非乳清抗原，且与羊乳不存在交叉反应。