农杆菌介导的活体幼胚转化获得转基因棉花的方法

摘要

一种农杆菌介导的活体幼胚转化获得转基因棉花的方法，由无菌胚剥离、制备转化液、震荡侵染、制备转基因棉花、转基因植株鉴定步骤组成。在无菌胚剥离中，将30％双氧水与无菌水配制成消毒液，棉种脱绒放入消毒液中，25℃、浸泡24小时，取出种子放在培养皿内，切掉种皮和1/3～1/2子叶，剩余的棉花胚放入含有基础培养基的培养皿中，让棉花胚受伤；在制备转化液步骤中，诱导液由乙酰丁香酮与硫酸镁制成，乙酰丁香酮能够诱导农杆菌Vir基因活化，提高外源基因整合的效率；在震荡侵染步骤中，转化液中加入Silwet L-77和MS液体培养基，使农杆菌更大范围覆盖在棉花胚上。本发明具有易于筛选、棉花的生长周期短、易于操作、转化效率等优点。

主权项

一种农杆菌介导的活体幼胚转化获得转基因棉花的方法，其特征在于由下述步骤组成：(1)无菌胚剥离将30％双氧水与无菌水按体积比为1：9混合配制成消毒液，棉种脱绒放入消毒液中，25℃、浸泡24小时，取出种子放在培养皿内，切掉种皮和1/3～1/2子叶，剩余的棉花胚放入含有基础培养基的培养皿中，1000mL基础培养基由下述原料配比：混匀，调pH为5.8～6.3，0.07MPa、115℃在高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟，分装在培养皿中，自然冷却，制备成基础培养基；(2)制备转化液在LB液体培养基中加入50mg/mL卡那霉素、50mg/mL利福平、50mg/mL链霉素、含有GFP表达载体的农杆菌LBA4404，LB液体培养基与100mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、100mg/L链霉素、GFP表达载体的农杆菌LBA4404的体积比为1：0.002：0.001：0.0012：0.1，28℃、200转/分钟振荡培养22～24小时，制备成OD₆₀₀为1.2～1.6的菌液，5000转/分钟离心10分钟，去除上清液，收集菌体，加入MS液体培养基和诱导液，混匀，菌体与MS液体培养基、诱导液的体积比为1：5～15：0.05～0.2，28℃、200转/分钟振荡培养20分钟，得到转化液；GFP表达载体用重组质粒pBI121‑GFP转化到农杆菌LBA4404中得到重组农杆菌，所述重组质粒pBI121‑GFP是将pBI121的Xba I和Sac I酶切识别位点之间的小片段取代为GFP的序列得到的重组质粒。上述的100mL的LB液体培养基由下述原料配比：混匀，调pH为6.5，0.07MPa、115℃在高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟制成；上述的100mL MS液体培养基由下述原料配比：蔗糖        2gMS培养基    0.443g水          加至100mL混匀，调pH为5.8～6.3，0.07MPa、115℃在高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟制成；上述的诱导液由100μmol/L的乙酰丁香酮与10mmol/L的硫酸镁按体积比为1：1混合制成；(3)震荡侵染在转化液中加入Silwet L‑77和MS液体培养基，Silwet L‑77与MS液体培养基、转化液的体积比为1：4000～6000：4000～6000配制成侵染液，将制备的棉花胚放入侵染液，28℃、200转/分钟振荡培养3小时，得到含有农杆菌的棉花胚；(4)制备转基因棉花基础培养基在0.07MPa、115℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟，冷却至45～50℃，加入50mg/mL卡那霉素、500mg/mL头孢霉素，混匀，基础培养基与100mg/L卡那霉素、500mg/L头孢霉素的体积比为1：0.002：0.001，配制成筛选培养基，分装入培养皿，将含有农杆菌的棉花胚移入培养皿，放入24±1℃、光照强度为24000lux、湿度为51％的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，培养2～3天，选择长势优良的棉苗移入促生根培养基的组培瓶中，促生根培养基由基础培养基在0.07MPa、115℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟，冷却至45～50℃，加入1.25mg/mL6‑苄基嘌呤、0.5mg/mL萘乙酸、50mg/mL卡那霉素、500mg/mL头孢霉素，混匀，基础培养基与1.25mg/L6‑苄基嘌呤、0.5mg/L萘乙酸、100mg/L卡那霉素、500mg/L头孢霉素的体积比为1：0.001：0.001：0.002：0.001，配制成，分装到组培瓶中，将种有棉花幼苗的组培瓶放入24±1℃、光照强度为24000lux、湿度为51％的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，培养2～3周，选取真叶为绿色的棉花幼苗嫁接到生长2～3周的棉花砧木上，获得转基因棉花；(5)转基因植株鉴定对嫁接1～3个月的棉花幼苗绿色真叶提取DNA进行PCR分子检测，测序；对嫁接1～3月棉花幼苗的真叶提取RNA，反转录为cDNA，进行PCR分子检测，嫁接1～3个月棉苗进行荧光观测。