一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法

摘要

本发明公开了一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法，是将待测样品研磨，制备检测样品上样液，配制阳性、阴性及空白对照上样液，测出阳性对照上样液的病毒粒体平均数d。将2.0~2.5µl检测样品上样液、阳性、阴性及空白对照上样液分别点在硝酸纤维素膜上，将膜干燥后封闭0.8~1.2h，依次加入稀释后的一抗、二抗，分别反应0.8~1.2h，每次反应后洗膜3~4次，每次5~6min。将膜稍干燥后置于荧光分光光度计中检测荧光强度m，按照下述公式计算检测样品上样液中待检测病毒的粒体平均数d。阳性对照上样液m值：阳性对照上样液d值=检测样品上样液m值：检测样品上样液d值。所述方法能够实现植物病毒的灵敏准确、快捷高效的定量分析，推广应用价值较高。

主权项

一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法，其特征在于包括检测样品及试剂配制、检测及定量分析工序，具体包括：A、检测样品及试剂配制：按重量体积比1：2.5~3.5g/ml，将0.8~1.2g待检测植物样品加入磨样缓冲液中，将植物样品磨碎备用，作为检测样品上样液；按体积比1：1000，将提纯的待检测植物病毒用磨样缓冲液稀释备用，作为阳性对照上样液，并于电镜下测算出阳性对照上样液的病毒粒体平均数d；按重量体积比1:2.5~3.5g/ml，将0.8~1.2g无待检测病毒的植物样品加入磨样缓冲液中，将植物样品磨碎备用，作为阴性对照上样液；空白对照上样液即为磨样缓冲液；B、检测：将检测样品上样液2.0~2.5µl点在硝酸纤维素膜上，再将同样体积的阳性对照上样液、阴性对照上样液及空白对照上样液分别点在硝酸纤维素膜上，将硝酸纤维素膜干燥后，置于容器内，加入封闭液浸没0.8~1.2h，弃去封闭液，加入用稀释缓冲液稀释的一抗，反应0.8~1.2h，弃去一抗，用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3~4次，每次5~6min，再加入用稀释缓冲液稀释的二抗，反应0.8~1.2h，弃去二抗，用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3~4次，每次5~6min；所述的二抗为荧光素标记的二抗；C、定量分析：将洗涤后的硝酸纤维素膜稍干燥，置于荧光分光光度计中检测荧光强度m，按照下述公式即可算出检测样品上样液中待检测病毒的粒体平均数d：阳性对照上样液m值：阳性对照上样液d值=检测样品上样液m值：检测样品上样液d值其中，阳性对照上样液d= N₁+N₂+N₃+……N_y/y；y：电镜下观察视野的个数；N：第y个观察视野中的病毒粒体数。