一种基于组织芯片的肿瘤特异性靶点及靶向配体筛选方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于组织芯片的肿瘤特异性靶点及靶向配体筛选方法。本发明的目的在于克服现有技术中药物或靶向治疗通用性不高、筛选系统与肿瘤在体生存环境差距大、筛选通量小、费时费力的缺点，提供一种利用组织芯片筛选肿瘤特异性靶点及靶向配体的方法。利用本发明筛选到的靶向配体有较高的特异性，可穿越肿瘤细胞，不会引起免疫反应，通用性高。本筛选方法保持了肿瘤在体生长时原始状态，与荷瘤小鼠筛选系统相比，省去了动物饲养步骤，省时、省力、节约成本，且实验结果可比性强。与传统筛选系统相比，本发明可同时进行肿瘤特异性靶点分析和靶向配体的研究，且验证方法简单。

主权项

一种基于组织芯片筛选肿瘤特异性靶点和靶向配体的方法，包括组织芯片预处理、噬菌体扩增与纯化、噬菌体序列分析和抗原鉴定，其特征在于：(a). 组织芯片预处理：将组织芯片NC04‑01‑001或CS04‑03‑001于恒温烘箱中加热，后进行二甲苯脱蜡，分别用无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、70％乙醇及去离子水进行逐级水化；将处理好的组织芯片NC04‑01‑001或CS04‑03‑001进行内源化酶的消除，即用3％的H₂O₂浸泡10min，以降低非特异性染色；组织芯片NC04‑01‑001或CS04‑03‑001用柠檬酸缓冲液进行微波热修复后进行后续淘选过程；其中，组织芯片NC04‑01‑001为肺正常组织多个部位组织芯片，组织芯片CS04‑03‑001为肺鳞状细胞癌中分化组织芯片；(b). 淘选：(1)用免疫组化笔在组织芯片NC04‑01‑001或CS04‑03‑001上划定反应区域，加封阻液，4℃过夜；(2)甩掉组织芯片NC04‑01‑001或CS04‑03‑001上的封阻液，用0.05％TBST缓冲液洗6次；每次均旋转以使各个部位均被洗到，甩去TBST缓冲液；(3)用0.05％TBST缓冲液稀释扩增后的噬菌体至合适滴度，然后取150 μl加到组织芯片 NC04‑01‑001上，室温温和摇动60min；(4)将组织芯片NC04‑01‑001上的噬菌体溶液的大部分转移到组织芯片CS04‑03‑001上，室温温和摇动60min；剩余1μl用于测定滴度；（5）留下组织芯片CS04‑03‑001上的噬菌体溶液做滴度测定用；然后用0.05％TBST缓冲液洗10次组织芯片CS04‑03‑001，取第十次的洗液做滴度检测，用于初步判断0.05％TBST洗板效果，即每一轮淘选的特异性；(6)用150μl pH 2.2且含0.2M Glycine‑HCl和1mg/ml BSA的非特异性缓冲液来分离已结合的噬菌体，温和摇动10min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中；然后再用22.5μl 1M Tris‑HCl中和上述洗脱液；(7)按常规噬菌体滴度测定方法测定1μl洗脱物的滴度；(8)将剩余洗脱物加入到20ml ER2738培养物中，37℃剧烈摇动培养4.5h；(9)将培养物转入一离心管中，然后4℃ 10000rpm离心10min；上清液转入另一离心管中，再离心；(10)将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl；让噬菌体4℃沉淀过夜；(11)在4℃条件下10000rpm离心PEG沉淀15min；倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液；(12)沉淀物重悬于1ml TBS中，悬液转入微量离心管中，在4℃条件下离心5min使残余细胞沉淀；(13)上清液转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀；冰上孵育30min；在4℃条件下离心10min，弃上清液，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清液；(14)沉淀物重悬于200μl 0.02％NaN₃ TBS中；离心1min，沉淀任何残余的不溶物；上清转入新鲜管中；此即为扩增后的洗脱物；(15)根据常规方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物滴度；剩余洗脱物在4℃条件下贮存；(16)根据计数板上蓝斑数来确定滴度；用这个值来计算相应于初始的噬菌体加入量；(17)进行第二轮淘选：用第一轮淘选扩增的洗脱物中相当于第一轮初始加入量的噬菌体量重复步骤(1)‑(16)，在步骤（2）和步骤（4）的清洗步骤中将Tween的浓度增至0.1％ w/v； (18)进行第三轮淘选：用第二轮淘选扩增的洗脱物中相当于第一轮初始加入量的噬菌体量 重复步骤(1)‑( 6)，步骤（2)和步骤(4）清洗步骤中用0.5％ w/v的Tween；(19)在LB/IPTG/Xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度；第三轮洗脱物不必再扩增，滴度测定时得到的噬菌斑做测序用，平板培养时间不超过18小时，其余洗脱物在4℃条件下贮存；(c).将步骤(b)中得到的特异性结合组织芯片CS04‑03‑001的配体混合物进行序列分析，选出共有序列高的特异性配体；(d).将步骤(c)中筛选到的共有序列高的特异性配体返回到组织芯片CS04‑03‑002上进行验证，然后对所得到的配体进行特异性和通量分析；(e).利用特异性配体来鉴定其所结合的抗原。