一种化学发光测定三聚氰胺的方法

摘要

本发明属于化学发光传感器领域，涉及利用目标诱导链释放技术，结合杂交链式反应和化学发光技术测定三聚氰胺（Me）的方法。当有目标物Me存在时，Me与功能化磁珠FMB1表面的双链DNA中的适体DNA1作用，释放出适体的互补序列DNA2。释放出来的互补序列DNA2与另一功能化的磁珠（FMB2）作用，在修饰HRP的发夹 DNA（HRP-H1和HRP-H2）存在下进行链式杂交反应，使两种修饰的DNA生长成为一条长的双链DNA。通过磁性分离，再利用HRP对luminol-H₂O₂化学发光体系的催化作用产生化学发光，通过测定化学发光强度实现Me的测定。本方法具有高的选择性和检测灵敏度。

主权项

一种化学发光测定三聚氰胺的方法，其特征是包括以下步骤：FMB1的制备：将磁性金纳米粒子用磷酸缓冲液洗涤后，加入200 μl 1.0×10^‑5 M的DNA1和1.0×10^‑5 M的DNA2混合物，在37 ℃下反应12小时；将所得的功能化磁性金纳米粒子（FMB1）用磷酸盐缓冲液洗涤，然后分散在磷酸盐缓冲液中，保存在4 ℃下备用；FMB2的制备：将磁性金纳米粒子用磷酸缓冲液洗涤后，加入100 μl 1.0×10^‑5 M的H1，在37 ℃下反应12小时；将所得的功能化磁性金纳米粒子（FMB2）用磷酸盐缓冲液洗涤，然后分散在磷酸盐缓冲液中，保存在4 ℃下备用；制备HRP（辣根过氧化物酶）修饰的H1：在100 μl 1.0×10^‑5 M的H1中加入10 mg NHS（N‑羟基琥珀酰亚胺），20 mg EDC（1‑（3‑二甲氨基醛）‑3‑乙基二亚胺盐酸盐），在37 ℃下搅拌1小时，然后加入100 μl HRP，在37 ℃下搅拌过夜，即得；制备HRP修饰的H2：在100 μl 1.0×10^‑5 M的H2中加入10 mg NHS， 20 mg EDC，在37 ℃下搅拌1小时，然后加入100 μl HRP，在37 ℃下搅拌过夜，即得；Me（三聚氰胺）的检测：取含Me的标准溶液50 μL加入到200 μL的FMB1溶液，37 ℃反应40分钟，然后混合物在磁力架上分离，将上清液转移到FMB2溶液中；然后加入含有 5.0×10^‑7 M HRP‑H1和 5.0×10^‑7 M HRP‑H2溶液200 μL，在 37 ℃反应 1 h后进行磁分离，除去上清液，将磁珠用 100 μL磷酸缓冲溶液清洗两遍后，分散于1.0 ml磷酸缓冲溶液中，然后利用luminol‑H₂O₂化学发光体系进行化学发光检测;DNA1的部分序列为：5′‑TTT TTT TTT TTT CCA AAA GGG‑(CH₂)₆‑SH‑3；DNA2的部分序列为：5′‑TGG AAA AAA AAA AAA‑3′；H1的部分序列为：5′‑NH₂‑(CH₂)‑GCG AGG TTT TTT TTT TTT CCA GCG CCG CAC AGA TGG AAA AAA AAA AAA‑3′；H2的部分序列为: 5′‑TGG AAA AAA AAA AAA AGG GTA GCG CCG TTT TTT TTT TTT CCA ATT AGA‑(CH₂)₆‑NH₂‑3′。