SCF-Fc融合蛋白

摘要

本发明提供了一种SCF-Fc融合蛋白，其特征在于，所说的SCF包括胞外区全部序列，所说的Fc片段包括铰链区、CH2区和CH3区，所说的SCF与Fc序列之间为直接融合或通过连接序列融合。本发明的SCF-Fc融合蛋白可用于建立溶细胞性SCF-Fc融合蛋白，一过性的清除cKit表面受体阳性的造血干细胞，激活骨髓造血干细胞微环境－Niche,促进造血干细胞归宿至干细胞微环境，诱导和增强混合嵌合体的形成，以诱导移植免疫耐受，还可以应用于对血液系统遗传性细胞异常疾病的干细胞治疗；用于建立非溶性的SCF-Fc融合蛋白可以应用于SCF的替代疗法，以及用于标记和分离骨髓造血干细胞。

主权项

SCF‑Fc融合蛋白的制备方法，所说的SCF包括胞外区全部序列，所说的Fc片段包括铰链区、CH2区和CH3区，所说的SCF与Fc序列之间为直接融合或通过连接序列融合，所说的SCF选自人、小鼠或大鼠的SCF，所说的Fc片段选自人、小鼠或大鼠的IgG、IgM、IgD、IgA或者它们的亚型，所说Fc片段选自天然型Fc或与受体和/或补体结合相关的氨基酸改变的突变型Fc，其中，     人SCF的氨基酸序列如SEQ ID.1 所示，核苷酸序列如SEQ ID.2所示，     小鼠SCF的氨基酸序列如SEQ ID.3所示，核苷酸序列如SEQ ID.4所示，     大鼠SCF的氨基酸序列如SEQ ID.5所示，核苷酸序列如SEQ ID.6所示，     所说的天然型Fc片段选自人IgG1、小鼠IgG2a或大鼠IgG2a，其中人IgG1的氨基酸序列如SEQ ID.7 所示，小鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID.8 所示，大鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID.9 所示，    所说的突变型Fc片段选自突变型人IgG1或小鼠IgG2a，其中突变型人IgG1的氨基酸序列如SEQ ID.10 所示，突变型小鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID.11 所示，    其特征在于，所述的SCF‑Fc融合蛋白采用如下方法制备而成：     步骤一：干细胞生长因子与Fc融合蛋白表达质粒的构建     人‑干细胞生长因子的基因构建方法如下：以购自Thermo Open Biosystems公司的cDNA克隆为模板，cDNA克隆的货号为MHS4426‑99239430，扩增人SCF胞外区全序列，GenBank序列号为BC126166.1，上游引物引入NotI位点、Kozak序列：P1: 5' ATATGGCGGCCGCCGCCACCATGAAGAAGACACAAACTTG 3'，    下游引物引入BamHI位点，P2: 5'ctctgGGATCCCAGTGTAGGCTGGAGTC 3'；     反应体系为50μl，其中浓度为50pM/μl引物各加0.5μl，浓度为2.5mM Each的dNTP加0.8μl，所用DNA聚合酶为江苏省弗泰生物科技有限公司生产的pfu DNA polymerase，2.5U/μl，加0.8μl；反应条件为94℃ 30秒、54℃ 30秒、72℃ 45秒，25个循环后；将得到的基因产物用江苏省弗泰生物科技有限公司生产的DNA凝胶回收试剂盒纯化后，用NotI和BamHI酶切、回收、连接克隆至实验室保存的pRc‑CMV‑Fc表达载体系统；pRc‑CMV‑Fc表达载体系统是经改造的带有优化的多克隆位点、信号肽序列、Fc片段系统，Fc片段系统为人、小鼠或大鼠天然型Fc，或相应突变型Fc，将Human SCF连接至pRc‑CMV‑ Fc，Fc选自Human IgG1，即得溶细胞性人SCF‑Fc融合蛋白的表达质粒，同理，将Human SCF连接至pRc‑CMV‑Fc，Fc选自Mouse IgG2a，即得溶细胞性人SCF‑mFc融合蛋白的表达质粒；将Human SCF连接至pRc‑CMV‑Fc，Fc选自突变型Human IgG1，即得非溶细胞性Human SCF‑Fc融合蛋白的表达质粒；     所述的小鼠‑干细胞生长因子与Fc融合蛋白表达质粒和大鼠‑干细胞生长因子与Fc融合蛋白表达质粒，采用同样的方法构建；小鼠‑干细胞生长因子的基因构建所用模板及引物说明如下：    模板购自Thermo Open Biosystems 公司的cDNA克隆，cDNA克隆的货号为MMM1013‑65096，     引物P1：5' atatgGCGGCCGCTGGATCGCAGCGCTG 3'，     引物P2：5' CAGAGGGATCCTGTAGGCCCGAGTCTTCAG 3'    大鼠‑干细胞生长因子与Fc融合蛋白的基因构建：使用全基因合成的方法；     步骤二：干细胞生长因子与Fc融合蛋白的生产     包括如下步骤：    1）稳定的高表达细胞株的筛选    用冷的1×PBS将对数生长期的CHO细胞稀释至8 ×10⁶/ml后，取0.4ml悬液，加入电击杯，再加入15μg线性化表达质粒，混合后冰上静置10‑15min，设定电穿孔仪电压800V，电容25μF，点穿后电击杯在冰上静置10min，用移液管转移细胞至含5%1× FBS培养液的10cm 培养皿中培养，两天后待细胞生长状态恢复，用400 μg/ml的G418对阴性细胞进行筛选，观察细胞状态，每4天换液一次，培养两周后，采用极限稀释法，用96孔培养板进行高表达细胞株筛选，最终通过ELISA检测和比较筛选，得到稳定的高表达细胞株；     2）高表达细胞株的培养     根据需要，按每毫升培养液加5mg微载体计算，称取微载体，并在磷酸缓冲液PBS的液体模式下高压灭菌，将灭菌好的微载体移入搅瓶，待微载体沉淀后，弃去PBS，加入培养液，取出细胞培养皿中的处于对数生长期的SCF‑Fc高表达细胞，去上清液，加适量胰蛋白酶37℃消化2‑3min后，消化程度为显微镜下可见细胞漂浮并分散，加适量含血清的培养基终止消化并细胞计数，根据细胞计数结果和培养体积，将细胞和培养液混合并使细胞分散均匀，得到细胞悬液，悬液细胞密度为1‑5×10⁵/ml；待搅瓶中的微载体沉淀，弃去培养液，并将细胞悬液加入搅瓶，将搅瓶放入二氧化碳培养箱，二氧化碳培养箱内有5%二氧化碳，温度为37℃，调整搅瓶转速至50‑70rpm ，进行连续悬浮培养；     3）SCF‑Fc融合蛋白的纯化     发酵培养物经高速冷冻离心后收集培养上清，培养上清经离子截留分子量为10KD Pellicon，Pellicon购自Millipore公司，超浓缩15倍，然后用购自GE公司的Protein A亲合层析柱分离提纯，提纯的蛋白经1×PBS的透析最终得到SCF‑Fc融合蛋白。