抗草甘膦紫花苜蓿植株的筛选方法

摘要

本发明主要提供了产生对除草剂具有抗性的紫花苜蓿植株和方法。具体涉及利用化学诱变剂EMS诱变紫花苜蓿，筛选出对除草剂具有抗性的紫花苜蓿植株。一种抗草甘膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法，其特征在于包括如下步骤：(1)MS培养基萌发种子；(2)剂量筛选；(3)甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子；(4)抗草甘膦紫花苜蓿植株筛选；(5)抗性植株再次筛选。本发明的优点简便易行，见效快捷，在短期内可以获得抗除草剂紫花苜蓿的单株。本发明采用的是诱变手段。利用化学诱变剂EMS诱变紫花苜蓿种子产生点突变，通过培养基和土壤筛选两种途径筛选抗除草剂紫花苜蓿单株，不但为常规育种提供了新的种质资源，对其他植物的抗除草剂选育也提供了一定的参考。

主权项

一种抗草甘膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法，其特征在于包括如下步骤：(1)MS培养基萌发种子精选紫花苜蓿种子；配制MS培养基培养板备用；无菌条件下进行种子消毒：60‑100％酒精浸洗种子2‑0.5min；2％次氯酸钠溶液浸洗5‑15min；ddH₂O清洗种子3‑10次；铺板，用镊子将消过毒的种子均匀铺于MS培养基上，封口膜封口后置于人工培养箱，22‑18℃，0‑18h光照，6‑24h黑暗发芽；胚根突破种皮视为萌发，第3‑6天，平均发芽率达到50％以上，待用；(2)剂量筛选草甘膦设置多个处理，浓度分别为0mg/L至800mg/L，配置以上不同浓度的草甘膦培养基，每个浓度多个重复，设与浓度相匹配的多个培养板；无菌条件下，将MS培养基中发芽的健康种子转入不同浓度草甘膦培养基，封口膜封口后置于18‑22℃人工培养箱培养，于培养箱中培养18天，18天后统计致死率，筛选出用于培养基筛选的草甘膦致死剂量为600mg/L；(3)甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子紫花苜蓿种子用98％浓硫酸处理3‑10min先打破硬实，蒸馏水冲洗3‑10次；种子在100mM，pH7.0的磷酸缓冲液中，于4℃下预浸种6‑18h，用磷酸缓冲液配置浓度为0.2‑2.0％(v/v)的甲基磺酸乙酯溶液，在室温黑暗条件下用甲基磺酸乙酯处理种子，处理时长12‑24h，置于低温摇床，120rpm/min，18‑22℃不断摇晃，再用自来水冲洗2‑5h以去除残留的甲基磺酸乙酯，每25‑35min放置10‑20min；之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的种子，分装于离心管中；配制MS基本培养基培养板备用；在MS培养基萌发诱变后的种子，封口膜封口后置于人工培养箱，22‑18℃，0‑18h光照，24‑6h黑暗发芽；(4)抗草甘膦紫花苜蓿植株筛选配置添加了致死剂量600mg/L草甘膦的MS培养基培养板备用；无菌条件下，将步骤(3)中MS培养基萌发第3‑6天的健康种子转入添加了致死剂量的草甘膦培养基中，封口膜封口后置于22‑18℃人工培养箱培养，于培养箱中培养10‑20d，每天观察统计，10‑20d后筛选出抗性植株；配置1/2MS培养基，将筛选出的存活植株转入1/2MS培养基中继续培养，每2‑3天更换一次1/2MS培养基，待存活株长出复叶移栽到花盆继续生长；(5)抗性植株再次筛选将1/2MS培养基中长出一片复叶的幼苗移栽至土壤继续培养，待幼苗长至2‑3叶期开始用600mg/L的草甘膦溶液进行喷施，每隔4‑8d喷一次，喷施2次。