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一种检测人血小板糖原合酶激酶3β蛋白活性的方法，包括以下步骤：(1)血小板分离与纯化：人全血5ml，60g离心力，4摄氏度离心15min，上层是血浆，中层是白细胞，下层是红细胞；取上层成分血浆，60g离心力，4摄氏度离心15min，去沉淀，1500g离心15min，分为2层，上层为血清，下层为血小板；血小板标本用改良台氏液洗涤，1500g离心5min3次，储存于‑80℃冰箱；(2)血小板蛋白提取与浓度测定：血小板加入预冷的裂解液120μl 2×Buffer，所述的2×Buffer由50mM Tris‑Cl pH 8.0、1％NP‑40、150mM NaCl、0.1％SDS、0.02％NaNR3R、20％甘油、cocktail、1％PMSF组成，在冰上静置20min后，将蛋白样品置于沸水中煮10min使其蛋白充分变性，60hz超声15秒，BCA法测定蛋白浓度；(3)血小板蛋白斑点印迹测定：血小板样品配置成统一浓度为5ug/ul，将2ul样品点于硝酸纤维素膜NC膜上，将NC膜晾干1‑2h后，置于含5％脱脂奶粉的封闭液中，摇床上室温封闭30‑60min，取出NC膜，用双蒸水冲洗干净，加入对应的一抗，所述的对应的一抗为含1％BSA的TBS稀释的1:1000GSK‑3β和Ser9‑GSK‑3β，4℃过夜。1×TBST缓冲液洗NC膜3次，每次5min，所述的1×TBST含100mM NaCl、50mM Tris、0.5％Tween 20、pH 7.4，接着用双蒸水清洗掉泡沫，用Licor公司标记IRDyeT 800通道的荧光二抗染料，所述的二抗用含1％BSA的TBS稀释为1:10000的抗体。室温下封膜孵育1h，1×TBST缓冲液洗膜3次，每次10min；双蒸水冲洗泡沫，荧光扫描、显色，分别测出GSK‑3β和Ser9‑GSK‑3β的灰度值，得到反映GSK‑3β活性的Ser9‑GSK‑3β/GSK‑3β比值。 |
