一种稳定、高效适于双向电泳的放线杆菌蛋白提取方法

摘要

本发明涉及一种稳定、高效适于双向电泳的放线杆菌蛋白提取方法。本发明对胸膜肺炎放线杆菌蛋白提取方法进行了优化，将液氮研磨与超声震荡结合，苯酚溶液与醋酸铵溶液相结合提高了蛋白质的提取效率。本发明的方法具有操作简便、省工省时、蛋白提取效率高、干扰物少的特点。该方法比较适合于蛋白提取困难、蛋白提取收率低、干扰杂质多的材料。同时所得蛋白易于二次溶解、杂质和干扰物少，完全满足双向电泳第一向和第二向的要求，可获得分辨率高、重复性好、蛋白点分布均匀、蛋白点清晰的图谱，对胸膜肺炎放线杆菌组学研究及免疫蛋白的筛选和疫苗候选蛋白筛选的研究具有重要的意义。

主权项

一种稳定、高效适于双向电泳的放线杆菌蛋白提取方法，其特征在于，操作步骤如下：(1)取‑80℃冷冻菌体，液氮研磨，准确称取0.05g粉末至2ml离心管中；(2)往离心管中加入等量的蛋白提取液，所用蛋白提取液配方为：0.5M Tris‑base，0.1M氯化钾，0.7M蔗糖，30mM盐酸，50mM DTT，50mM EDTA，40mMβ‑二巯基乙醇；(3)将上述溶液充分混匀后，恒温4℃超声震荡30min；(4)13200r／min4℃离心30min，收集上清液，上清液中加入等量的pH8.0的苯酚溶液；(5)4℃漩涡混悬15min，4℃13200r／min离心20min，收集酚相部分；(6)将酚相部分转移到另一个新的离心管中，加入等量的蛋白提取液重复提取三次，每次均收集酚相部分；(7)酚相中加入5倍体积的醋酸铵乙醇溶液‑20℃过夜，13200r／min4℃条件下离心30min，收集蛋白沉淀；(8)蛋白质沉淀用0.1M醋酸铵乙醇漂洗两次，然后再用‑20℃丙酮漂洗一次，用真空冷冻离心干燥机处理蛋白沉淀，获得蛋白粉末，置‑80℃冰箱中保存。