一种低氧后侧群分选人牙髓干细胞的实验方法

摘要

一种低氧后侧群分选人牙髓干细胞的实验方法，包括以下步骤：S1恒牙牙髓细胞原代培养；S2.低氧条件的模拟；S3.侧群细胞检测与分选，包括以下子步骤：S3-1，细胞预制；S3-2，侧群细胞流式检测；S3-3，侧群细胞流式分选：细胞预制后上流式机进行细胞分选，在状态良好细胞中收集侧群细胞至含20％胎牛血清的DMEM培养液的离心管，4℃保存；分选完成后1000rpm离心5min，小心抽弃上清，以适当的培养基吹匀制成细胞悬液，接种至6孔板，调整细胞浓度至5×10⁵个/ml，常规培养，获得人牙髓干细胞。本发明侧群分选出的牙髓干细胞具有较高的增殖能力、充足的细胞来源、对供者伤害小和无论理学限制等优点；且低氧培养后可促进人牙髓侧群细胞的表达。

主权项

一种低氧后侧群分选人牙髓干细胞的实验方法，其特征是包括以下步骤：S1恒牙牙髓细胞原代培养收集28岁以下患者完整拔除的健康阻生第三磨牙或因正畸拔除的双尖牙，表面经75％乙醇消毒和灭菌PBS冲洗后，自釉牙骨质界劈开牙齿，无菌条件下取出牙髓，浸泡于含青链霉素的PBS溶液中剪碎，以1:1的比例加入3mg/ml的I型胶原酶和4mg/ml的Dispase消化液，37℃消化60min后离心；离心沉淀物加入DMEM培养基充分混匀，反复吹打以机械力离散细胞团块，过40μm细胞筛，获得单细胞悬液；再次离心后用含20％FBS的DMEM调整细胞浓度为1×10⁴个/ml，接种于75cm²培养瓶，置于5％CO₂、饱和湿度37℃恒温培养箱中培养，8－12d达70％汇合时，即按1:3传代；S2.低氧条件的模拟用2％O₂and 2％FBS的低氧和低血清模拟体内缺血状态24‑48h，其中低氧状态由气体混配器实现，即通过二氧化碳、空气、氮气流量计，使二氧化碳、空气、氮气按所需比例混配至低氧盒，在低氧盒中的氧浓度由氧浓度仪监测；S3.侧群细胞检测与分选，包括以下子步骤：S3‑1，细胞预制：第二代人恒牙牙髓细胞经过24‑48h体外缺血培养，胰酶消化后，用37℃含2％胎牛血清DMEM重悬后计数；调整细胞悬液浓度约为1×10⁶个/ml，加入50ml离心管，分别设实验组和对照组；两组均加入荧光染料Hoechst33342，使终浓度为3‑5μg/ml，对照组还加入ABCG2抑制剂维拉帕米，使终浓度为50μM；37℃水浴避光孵育90min；孵育过程中每间隔15min摇晃孵育管；孵育结束后，立即4℃离心细胞或冰上急冷后离心，用冰预冷的PBS液重悬细胞；细胞悬液过滤网去除细胞团块，吹打均匀后待上机检测；S3‑2，侧群细胞流式检测：预先清洗流式细胞仪内部管道后上样，Hoechst33342用紫外激光激发，450nm边缘长通滤片接受Hoechst蓝光，675nmBP接受Hoechst红光；选取线性信号，做Hoechst Red和Hoechst Blue二维散点图，将Hoechst Red及Hoechst Blue弱信号且维拉帕米对照组缺失的区域设定为侧群细胞的门，计算百分比；S3‑3，侧群细胞流式分选：细胞预制后上流式机进行细胞分选，在状态良好细胞中收集侧群细胞至含20％胎牛血清的DMEM培养液的离心管，4℃保存；分选完成后1000rpm离心5min，小心抽弃上清，以适当的培养基吹匀制成细胞悬液，接种至6孔板，调整细胞浓度至5×10⁵个/ml，常规培养，获得人牙髓干细胞。