一种防风愈伤组织超低温保存技术

摘要

本发明公开了一种防风愈伤组织超低温保存技术，即以防风种子诱导得到的愈伤组织为材料建立了防风离体超低温保存技术体系，从而有效地保护了防风优良种质资源。本发明经过愈伤组织诱导、预培养、装载、脱水、冷冻、洗涤、再培养及再生等过程实现了防风愈伤组织超低温保存，可作为一种长期稳定保存种质资源的方法，降低保存经济成本，有效地保护了珍稀的种质资源，为科学研究提供了极大帮助。

主权项

一种防风愈伤组织超低温保存技术，其特征在于包括以下工艺步骤： （1）外植体的处理：选取当年收饱满的防风种子，以洗洁精水刷洗，置于自来水中冲洗10～30min后置于清水中浸泡8～12h，再转入50～120mg/mL的赤霉素溶液中浸泡10～15h，然后在超净工作台中以75～80%乙醇溶液浸泡10～30s，无菌水冲洗3～5次，再用含有0.01～0.05%吐温‑20的0.1～0.5%升汞溶液消毒5～10min，无菌水冲洗3～5次后用无菌滤纸吸干表面的水分后备用；（2）愈伤组织诱导：用无菌解剖刀在经步骤（1）处理后的种子上割1～3刀造成伤口后接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，接种后在25～28℃条件下进行全暗培养直至形成愈伤组织；（3）预培养：将步骤（2）得到的3周龄的长势良好的愈伤组织转接至预培养基中进行预培养，接种后在1～5℃条件下培养1～5天后检测细胞存活率；（4）装载处理：将经步骤（3）处理后存活的愈伤组织切成1cm³左右大小，放入10mL冷冻管后加40%～60%玻璃化保护剂PVS2在室温下装载处理10～40min；（5）脱水及冷冻：将经步骤（4）处理后的愈伤组织转至预冷至2℃的100%的玻璃化保护剂PVS2中在1～5℃处理20～60min后将冷冻管投入液氮中冷冻处理；（6）化冻及洗涤：愈伤组织在液氮中保存24h后，取出冷冻管，在40℃水浴中化冻，化冻过程中不断振荡冷冻管，使管内愈伤组织和保护剂受热均匀,然后用含0.5～1.0mol/L的MS培养液在室温下洗涤3～5次，每次10min；（7）再培养：将经化冻后的愈伤组织用无菌水冲洗5～8次后立即转移至继代培养基中进行增殖培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养10～20天，然后置于每天光照12～16小时，光照强度为2000～3000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养；（8）芽诱导：将步骤（7）培养至15～20天的长势良好的愈伤组织转接至分化培养基中进行不定芽诱导，接种后先在25～28℃条件下全暗培养2～5天，然后置于每天光照12～16小时，光照强度为2000～3000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成不定芽；（9）生根培养：当丛生芽长至2.5～3.5cm高时，将丛生苗切割成单苗接种至生根培养基中进行生根培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～4天，然后置于每天光照12～16小时，光照强度为2000～3000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养直至长出根；（10）试管苗移栽：当小苗长出的新根系长达2～3.5cm，并且长出侧根，苗高5cm以上时，将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5～7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入由黄沙土和火碳泥（1：1）混合成的基质中并定植于大田中。