一种适用于纤维堆囊菌的新型TALEN载体及其构建方法

摘要

本发明公开了一种适用于纤维堆囊菌的新型TALEN载体及其构建方法。本发明首次将适用于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的启动子P43替换适用于真核生物的启动子，将构建成功的靶标目的基因的左右臂TALEN元件和靶标基因共同转入纤维堆囊菌，用Western blot验证重组蛋白是否表达，从而验证所构建的载体能在纤维堆囊菌中行使基因敲除的功能，进一步拓宽TALEN技术的应用范围，促进生物技术的发展。

主权项

一种适用于纤维堆囊菌的新型TALEN载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：根据目的基因的碱基序列确定靶标序列，再确定靶标序列上下游的靶标识别域碱基序列，根据上下游的靶标识别域碱基序列设计TAL重复单元，分别得到上游的TALE重复单元和下游的TALE重复单元，将上游的TALE重复单元连接至Ptalen L48载体上，下游的TALE重复单元连接至Ptalen R36载体上；再用内切酶HindIII和SpeI酶切Ptalen L48载体和上下游含有内切酶HindIII和SpeI位点的P43启动子，再进行连接反应，使P43启动子代替启动子pGPD插入到酶切位点HindIII和SpeI之间，得到载体P43LTALEN；再用内切酶AscI和SpeI酶切Ptalen R36载体和上下游含有内切酶AscI和SpeI位点的P43启动子，再进行连接反应，使P43启动子代替启动子pGPD插入到酶切位点AscI和SpeI之间，得到载体P43RTALEN；载体P43LTALEN和载体P43RTALEN即为适用于纤维堆囊菌的新型TALEN载体。