一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法

摘要

本发明涉及一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法，包括如下步骤：（1）将产酶菌株接种于发酵培养基中，培养30h～80h，制得发酵液；（2）将发酵液经菌体分离、菌体破壁、酶纯化，制得的海藻糖合成酶液；（3）进行交联包埋反应，制得固定化海藻糖合成酶；（4）将固定化海藻糖合成酶与麦芽糖底物溶液混合，经转化、分离，制得海藻糖。本发明转化率高、反应速度快、作用时间短、酶活稳定性及机械强度高的固定化海藻糖合成酶，从而提高了海藻糖的生产效率，降低了生产成本，缩短了生产周期。

主权项

一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将产酶菌株接种于发酵培养基中，在温度28℃~33℃的条件下，培养30 h~80 h，制得发酵液；上述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：麦芽糖1%~10%，蛋白胨0.4%~2%，牛肉膏0.2%~1%，KH₂PO₄ 0.1%~1%，MgSO₄∙7H₂O 0.01%~0.12%，余量水，pH 6.0~8.0；上述产酶菌株选自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、玫瑰链霉菌（Streptomyces roseoflavus）或大肠杆菌（Escherichia coli）；（2）将步骤（1）制得的发酵液经菌体分离、菌体破壁、酶纯化，制得的海藻糖合成酶液的酶活为35 U/g湿菌体～60 U/g湿菌体；具体步骤如下：将发酵液在4℃条件下进行6000 r/min冷冻离心10min～20 min，收集湿菌体，用浓度1mol/L的磷酸钠缓冲液悬浮菌体，制成菌悬液，再采用高压均质机，在温度为4℃，破碎压强为140 Mpa的条件下，进行菌体的破碎，4℃条件下6000 r/min冷冻离心10min～20 min后，收集所得的上清液即为粗酶液；在搅拌状态下，将固体硫酸铵粉末加入粗酶液中至浓度达到25℃条件下硫酸铵饱和度的30%~50%，离心后取上清液，制得海藻糖合成酶液；（3）在戊二醛质量浓度为0.5%～1.0%，海藻糖合成酶液与壳聚糖凝胶的体积质量比为1:1～6:1、pH 8.0、温度12℃～25℃的条件下，体积质量比单位为ml/g，进行交联包埋反应9 h～20 h，制得固定化海藻糖合成酶；（4）将步骤（3）制得的固定化海藻糖合成酶与麦芽糖底物溶液混合，经转化、分离，制得海藻糖；所述的麦芽糖底物溶液为质量浓度10%～30%的麦芽糖溶液，溶液pH 7.8～8.0；所述固定化海藻糖合成酶与麦芽糖底物溶液混合的体积比为（4～8）:1；所述转化温度为38℃～45℃，转化时间20h～30h，转化过程中的搅拌速度为120 r/min～200 r/min；所述步骤（4）还包括将分离后获得的固定化海藻糖合成酶经水浸泡清洗后，重复利用的步骤。