过表达Galectin-1基因编码蛋白永生化细胞的制备方法

摘要

本发明涉及一种过表达Galectin-1基因永生化细胞系的制备方法，其特征在于：首先设计针对Galectin-1基因的特异性引物，使用RT-PCR扩增鼠源Galectin-1整个编码基因，然后连接pMD-18T载体，经酶切和PCR鉴定正确后测序，测序正确后命名为pMD-Ga；然后，酶切pMD-Ga获得Galectin-1基因片段，相应的克隆至真核表达载体pIRESneo的多克隆酶切位点中，再经经酶切和PCR鉴定正确获得pIRESneo-Ga质粒；大量制备高纯度的pIRESneo-Ga质粒使用FuGENE转染试剂转染BHK细胞系，经G418抗性压力筛选，获得稳定的细胞克隆，扩大培养后，再经Western blot验证获得过表达Galectin-1基因的稳定的细胞系；其容易培养，增殖速度快速，可无限扩大，性质稳定，易保存，方法技术成熟，重复性强，一般研究人员即可完成。

主权项

一种过表达Galectin‑1基因编码蛋白永生化细胞的制备方法，其特征在于，它的步骤如下：1）自BHK细胞提取总RNA，应用RT‑PCR方法扩增Galectin‑1基因，并与真核表达载体pIRESneo构建表达质粒pIRES‑Ga；2）用Luria‑Bertani Medium培养基培养1‑3ml浓度为1‑1.5 OD₆₀₀值的含目的基因重组质粒菌液，通过超纯质粒纯化试剂盒制备无内毒素的超纯质粒；3）用含5‑10小牛血清的Minimum Essential Medium作为基础培养基，重组pIRESneo‑Ga质粒经FuGENE转染试剂介导传染70‑80%融合的生长旺盛的单层BHK细胞；4）在含500μg/ml浓度G418的Minimum Essential Medium的培养基中，通过极限稀释法获得单克隆化细胞；5）单克隆化细胞经RT‑PCR、Western Blot检测后，获得含目的基因的永生化细胞。