利用CRISPR-Cas9特异敲出microRNA基因家族的方法

摘要

本发明公开了一种利用CRISPR-Cas9特异敲除microRNA基因家族的方法，主要采用CRISPR/Cas9系统敲除目的基因。这是首次利用CRISPR/Cas9系统特异性的将micrRNA家族敲除。利用这种新的方法可克服传统转基因的一次仅能敲除一个基因的弊端，加速了模型生物的建立缩减至3周；同时构建步骤简单，也减少了昂贵的分子试剂；本发明构建基因修饰小鼠在周期上大大缩短，减少至4个月；可以一次构建多个基因的同时敲除；资金投入明显减少，只需5万元即可得到F1代小鼠；基因修饰效率可达90％以上，降低了传统技术的不可靠性；操作技术简单，无需通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤。

主权项

一种利用CRISPR‑Cas9特异敲除microRNA基因家族的方法，其特征在于所述方法为：(1)以px330质粒为模板，在引物Cas9‑R和含T7启动子的引物Cas9‑F作用下进行PCR反应，将PCR反应产物与pGME‑T载体连接，获得质粒pGEM‑Cas9，再将质粒pGEM‑Cas9经线性化、体外转录及RNA纯化试剂盒回收，获得Cas9mRNA；(2)以px330质粒为模板，在引物sgRNA‑R和含T7启动子的引物sgRNA‑F的作用下进行PCR反应，再将PCR扩增产物与载体pGEM‑T连接，获得载体pGEM‑T7‑sgRNA；(3)将SEQ ID NO.3所示的miR‑154sgRNA和SEQ ID NO.4所示miR‑382sgRNA分别与载体pGEM‑T7‑sgRNA连接，分别获得质粒T7‑sgRNA‑miR‑382和质粒T7‑sgRNA‑miR‑154，经线性化、体外转录及RNA纯化试剂盒回收，获得T7‑sgRNA‑miR‑382mRNA和T7‑sgRNA‑miR‑154mRNA；(4)将Cas9mRNA、T7‑sgRNA‑miR‑382mRNA和T7‑sgRNA‑miR‑154mRNA混合成混合液，注射哺乳类动物受精卵，实现将microRNA基因定点敲除的目的；Cas9‑F：5’‑TTAATACGACTCACTATAGGATGGACTATAAGGACCACGAC‑3’；Cas9‑R：5’‑GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC‑3’；sgRNA‑F：5’‑TTAATACGACTCACTATAGGGTGGAAAGGACGAAACACCGGGTCTTCGAGAAGACCT‑3’；sgRNA‑R：5’‑AAAAGCACCGACTCGGTGCC‑3’。