石墨烯电化学发光生物传感器检测乙醇的方法

摘要

本发明涉及石墨烯电化学发光生物传感器检测乙醇的方法。将酶与电化学发光试剂Ru(bpy)₃²⁺协同固定在石墨烯、PEDOT及PSS功能化纳米膜上。通过静电引力作用，带正电荷的Ru(bpy)₃²⁺有效固定在带负电荷的电极表面。作为电子高速传输通道的石墨烯具有高度共轭、强疏水性及大表面积的独特优势，为吡啶钌的有效固定提供良好平台。高电导性的PEDOT作为优秀导电膜材料改善了复合纳米膜的导电性。石墨烯电化学发光生物传感器检测乙醇具有节省试剂、灵敏度高、选择性好以及操作简单的优势。对乙醇标准溶液检测的线性范围为2.5×10^–5-2.5×10^–2mol/L，检测下限为2.5×10^-6mol/L。

主权项

石墨烯电化学发光生物传感器检测乙醇的方法，其特征在于步骤和条件如下：检测步骤和条件仪器装置电化学发光综合分析仪；铂丝对电极；Ag/AgCl参比电极；试剂及材料三联吡啶钌的六水合氯化物（Ru(bpy)₃²⁺），乙醇脱氢酶 (ADH)，β‑尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD⁺)，NaH₂PO₄，Na₂HPO₄，氨水，联氨；聚3,4‑乙撑二氧噻吩（PEDOT）；聚苯乙烯磺酸(PSS)；氧化石墨烯；溶液的制备（1）NAD⁺溶液制备用二次水配制1.25×10^‑3 mol/L NAD⁺溶液；（2）磷酸盐缓冲溶液制备配制浓度为200.0 mmol/L的NaH₂PO₄溶液和浓度为200.0 mmol/L的 Na₂HPO₄溶液，将同浓度的二者混合，再用二次水稀释配成浓度为100.0 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，调整磷酸盐缓冲溶液pH值为7.50；（3）背景溶液的制备将步骤1.1.3（1）制备的NAD⁺溶液与步骤1.1.3（2）制备的磷酸盐缓冲溶液混合，用二次水稀释获得背景溶液；背景溶液中NAD⁺浓度为1.25×10^‑4 mol/L，磷酸盐浓度为20 mmol/L；（4）乙醇标准溶液的制备将步骤1.1.3（1）制备的NAD⁺溶液与步骤1.1.3（2）制备的磷酸盐缓冲溶液混合；加入乙醇，用二次水稀释，获得乙醇标准溶液；其中NAD⁺浓度为1.25×10^‑4 mol/L，磷酸盐浓度为20 mmol/L，乙醇的浓度为2.5×10^‑3 mol/L；（5）检测样品溶液的制备将步骤1.1.3（1）制备的NAD⁺溶液与步骤1.1.3（2）制备的磷酸盐缓冲溶液混合；然后加入10 μL酒样品，用二次水稀释至400 μL，获得检测样品溶液；检测样品溶液中NAD⁺浓度为1.25×10^‑4 mol/L，磷酸盐浓度为20 mmol/L；1.1.4修饰电极溶液的制备（1）PEDOT‑PSS混合溶液的制备将1 mL的PEDOT与6 mL的PSS超声混合，配制成PEDOT‑PSS混合溶液；（2）PEDOT‑PSS‑G（G代表石墨烯）混合溶液的制备将步骤1.1.4（1）制备的PEDOT‑PSS混合溶液1.3 mL加入到1.25 mL氧化石墨烯中, 依次加入40 µL氨水和3.5 µL联氨，混合均匀；在容量瓶中用二次水稀释，定容至10 mL，获得的PEDOT‑PSS‑G混合溶液；（3）ADH溶液的制备将1mg ADH 溶解在100 μL二次水中，获得ADH 溶液；（4）NAD⁺溶液制备用二次水配制浓度为0.025 mol/L的NAD⁺溶液；（5）修饰电极溶液的制备将步骤1.1.4（3）获得的ADH 溶液20 μL与1.1.4（4）制备的NAD⁺溶液10 μL，以及步骤1.1.4（2）获得的PEDOT‑PSS‑G混合溶液20 μL共同混合，得到修饰电极溶液；（6）Ru(bpy)₃²⁺溶液制备用二次水配制浓度为 0.8 mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺溶液；的制备电极的准备将ITO电极用无水乙醇超声洗涤三次，再用二次水清洗三次，最后用氮气吹干；以聚二甲基硅氧烷为模板，将ITO电极固定为直径是10 mm的圆形；的制备取由步骤1.1.4（5）制备的修饰电极溶液8 μL涂覆在由步骤1.1.5.1制备的直径为10 mm圆形ITO电极上；室温条件下干燥，获得含复合膜的ITO电极；将含复合膜的ITO电极浸入由步骤1.1.4（6）制备的浓度为0.8 mmol/L Ru(bpy)₃²⁺溶液中，浸泡10 s后取出，在室温条件下干燥，获得石墨烯电化学发光生物传感器，将其贮存在4°C冰箱中备用；1.1.6 检测步骤1.1.6.1 乙醇标准溶液的循环伏安实验以步骤1.1.5.2制备的石墨烯电化学发光生物传感器作为工作电极，在步骤1.1.3（3）获得的背景溶液中循环扫描5 ‑ 10周，扫描电位区间是0 ‑ 1.30 V，记录稳定时的循环伏安曲线；然后以步骤1.1.5.2制备的石墨烯电化学发光生物传感器作为工作电极，用由步骤1.1.3（4）获得乙醇标准溶液进行循环扫描5‑ 10周，扫描区间同样为0 ‑ 1.30 V，记录稳定时的循环伏安曲线；将乙醇标准溶液获得的循环伏安曲线与背景溶液得到的循环伏安曲线进行比较，以确定测定检测乙醇的电化学活性区间；白酒样品中乙醇的检测将步骤1.1.3（5）得到的检测样品溶液按下述条件进行检测：电化学发光检测池位于光电倍增管上方；光电倍增管偏置电压设为800 V；扫描电位设置为0 ‑ 1.25 V；将步骤1.1.3（5）获得的检测样品溶液400μL添加到电化学发光检测池中；以步骤1.1.5.2制备的石墨烯电化学发光生物传感器作为工作电极，铂丝为对极，Ag/AgCl为参比电极；获得白酒样品中乙醇检测的电化学发光图谱。