一种同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种同时检测水稻四种病毒的多重PCR方法，通过对水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus，RGDV）、水稻齿叶矮缩病毒（Rice ragged stunt virus，RRSV）、南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）和水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）的引物浓度、酶的用量和PCR扩增条件等的优化，建立了一种同时检测水稻四种病原的方法。本方法主要包括以四种病毒基因序列为模板设计特异扩增引物；样品总RNA的提取；四重PCR优化；PCR扩增产物的凝胶电泳检测及结果分析。本发明实现了对田间复合侵染的水稻样品的快速检测，检测结果可靠、准确、特异性强，并缩短了检测时间，有利于研究田间4种病害的发生程度，在农业生产上具有重要的指导意义，为制定科学的病虫害防控体系提供了理论依据。

主权项

一种同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法，四种病毒为水稻瘤矮病毒（RGDV），水稻齿叶矮缩病毒（RRSV），南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）和水稻黑条矮缩病毒（RBSDV ），其特征在于，包括以下步骤：步骤一，扩增引物的设计；步骤二，样品总RNA的提取；步骤三，单重RT‑PCR检测；步骤四，四重RT‑PCR优化；步骤五，四重RT‑PCR的灵敏度分析；其中，步骤一中先下载病毒基因组序列，然后对下载的序列进行同源比对，以RGDV S8、 RRSV S8、RBSDV S6 和SRBSDV S10为模板，设计特异引物，利用BLAST在线软件检测特异引物，四种病毒的引物具体如下：水稻瘤矮病毒的引物为：上游引物：5’‑GTACTCAGACCTGAACGTAGT‑3’下游引物：5’‑CTCAATAGCGATCGCATACC‑3’水稻齿叶矮缩病毒的引物为：上游引物：5’‑CGCCGTATCTAACGTTCCAG‑3'下游引物：5'‑TGCCGCGACATAATCAAC‑3’南方水稻黑条矮缩病毒的引物为：上游引物：5’ –CGCGTCATCTCAAACTACAG‑3’下游引物：5’‑TTTGTCAGCATCTAAAGCGC‑3’水稻黑条矮缩病毒的引物为：上游引物：5’‑AATGCCACTTGCCAGTTACG‑3’下游引物：5’‑GCTACTTCGTCAGTTAGATC‑3’。