制备间充质干细胞、组合物和其试剂盒的方法

摘要

本发明公开了一种分离、汇集且进一步培养用于临床应用的间充质干细胞（MSC）的方法。本发明也公开了建立主细胞库（Master Cell bank）的方法，然后从工作细胞库（Working Cell Bank）制备最终治疗组合物供临床应用，该最终治疗组合物称为研究产品/研究医疗产品，其包含源于骨髓的异源MSC。

主权项

一种制备包括间充质干细胞、胎牛血清(FBS)和二甲基亚砜(DMSO)的主细胞库组合物的方法，所述方法包括以下步骤：a.获取骨髓并在培养基中稀释骨髓，所述培养基包括达尔伯克氏改良伊格尔培养基‑Knock Out[DMEM‑KO]、10％的胎牛血清[FBS]、1％的谷氨酰胺和0.5％的青霉素‑链霉素，将经稀释的骨髓离心以获得团块，并在所述培养基中稀释所述团块；b.向再次稀释的团块中加入浓度梯度溶液并离心以在界面处获得阻挡层；c.向所述阻挡层中加入等体积的所述培养基并离心以获得包含单核细胞(MNC)的团块，然后使所述团块悬浮于所述培养基中；接种40百万‑50百万个单核细胞(MNC)并在更换培养基的条件下培养所述细胞以达到80％至85％的汇合率，其中72小时后第一次更换培养基，然后每48小时更换培养基一次；d.将所述培养基吸出并用杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)清洗汇合细胞，然后用0.25％的胰酶/0.53mM EDTA处理细胞以获得经胰酶消化的细胞；e.用中和培养基中和所述经胰酶消化的细胞并离心所述细胞以获得包含间充质干细胞(MSC)的团块，然后将所述团块悬浮于培养基中；f.以6666个细胞/cm²的接种密度接种所述间充质干细胞并培养，在第7天或第8天更换培养基；g.在第14至第18天用0.25％的胰酶收获来自步骤f的细胞，用包含DMEM‑KO、10％FBS、0.5％青霉素‑链霉素的中和培养基中和胰酶处理过的细胞，收集至离心管中并以1200rpm至1500rpm的速度离心10分钟至20分钟以获得包含间充质干细胞的团块；以及h.将所述间充质干细胞悬浮于包含85％至95％的胎牛血清(FBS)和5％至15％的二甲基亚砜(DMSO)的冷冻培养基中以获得主细胞库组合物。