水稻放氧复合体蛋白基因OsPsbP及其克隆方法和用途

摘要

本发明公开了一种水稻放氧复合体蛋白基因OsPsbP及其克隆方法和用途。OsPsbP是从水稻中分离到的一个放氧复合体蛋白基因，由765个碱基组成，编码一个23 kD的定位于叶绿体的PsbP类放氧复合体蛋白，参与植物的光合作用和抗生物胁迫反应。在水稻中沉默该基因，植株表现出叶片偏白和生长迟缓的现象，并且对病毒的入侵更为敏感，植株发病提前且发病加重，而在水稻中过量表达该基因则能提高转基因水稻对病毒的抗性，植株发病相应推迟且发病症状减轻。故本发明提供的基因可以提高植物对病毒的抗性，可用于经转基因育种改良植物的抗病毒等生物胁迫的能力。

主权项

一种植物放氧复合体蛋白基因OsPsbP的功能分析方法，其特征在于包括下列步骤：1） OsPsbP蛋白的亚细胞定位：a)用T4连接酶把OsPsbP基因连接到植物表达载体pCHF3上获得质粒载体pCHF3‑GFP:OsPsbP；用电击法将质粒转化到农杆菌菌株C58C1中；将阳性的农杆菌培养至OD₆₀₀为0.6‑0.8，浸润4叶期的本氏烟叶片；36小时后取浸润叶切成1 mm×3 mm的小片，放入1%纤维素酶‘Onozuka’R10，0.25%果胶酶‘Onozuka’ R10，0.4 M甘露醇，10 mM CaCl₂，20 mM KCl，0.1%BSA，20 mM MES，pH 5.7的酶解液中缓慢震荡消化细胞壁2 h，释放出原生质体; 静置10 min，取10 μL绿色沉淀物放于载玻片上，在共聚焦显微镜下观察GFP的表达情况，结果表明，空载体中的GFP蛋白多在细胞质和细胞核中，而GFP: OsPsbP的融合蛋白以点状分布于叶绿体中，所发出的绿色荧光与叶绿体自发红光重合，因此可以断定OsPsbP蛋白能定位在植物的叶绿体中；b)用免疫胶体金标记法标记OsPsbP蛋白的亚细胞定位：采集野生型水稻叶片利用制备的OsPsbP多克隆抗体标记水稻细胞中OsPsbP蛋白，在电镜下只能在叶绿体中观察到黑色点状颗粒，而在细胞的其他部分均没有该蛋白的分布，再次说明OsPsbP是特异定位于叶绿体的蛋白；2）将OsPsbP基因构建到水稻转基因载体pCambia1305载体上获得重组质粒pCambia‑OsPsbP，将该质粒电击转化到农杆菌菌株EHA105中； OsPsbP基因经农杆菌介导转化水稻成熟胚愈伤，获得过量表达即上调OsPsbP基因的转基因35S‑OsPsbP水稻；同时通过Rice Genome Annotation Project网站即http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml获得OsPsbP基因表达下调的水稻即Ospsbp水稻突变体种子；将OsPsbP基因表达显著上调和下调的水稻和对照野生型日本晴水稻在相同的条件下一起培养观察表型，发现35S‑OsPsbP水稻表型正常，与野生型无异，但是Ospsbp水稻叶片明显发白，且植株偏矮，生长不良，与对照差异明显表明OsPsbP基因表达下调后植株生长会受到影响；3）将水稻条纹病毒RSV接种OsPsbP基因表达上调和下调的水稻以及野生型水稻，接毒后每天观察植株的发病情况，通过ELISA检测确认水稻感染RSV，Northern blot分析接毒水稻体内病毒含量，分析该基因对RSV病毒侵染的影响：结果发现与野生型水稻相比，35S‑OsPsbP转基因水稻叶片仍然较绿，出现黄色条纹的叶片较少，发病比对照推迟1‑2天，而Ospsbp突变体水稻发病时间显著提前，平均比对照提前2‑3天，且发病症状严重，水稻受RSV侵染20天时叶片大部分变黄，植株几近枯萎；ELISA检测发现Ospsbp突变体水稻饲毒7天时90%的植株可以检测到病毒，此时对照只有50%感染RSV，而35S‑OsPsbP转基因水稻中感病植株更少，约有35%；进一步用Northern blot分析发现在35S‑OsPsbP转基因水稻中能够检测到的病毒量远低于对照，而Ospsbp突变体水稻中的病毒量则显著高于对照，表明植株中OsPsbP蛋白表达量能够影响病毒的侵染效率，OsPsbP蛋白表达量越高侵染效率越低。