一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法

摘要

本发明公开了一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法，栉孔扇贝担轮幼虫专用细胞培养基中添加维持细胞代谢需求的少量营养因子，即实现了栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的良好生长状态，随着细胞的分裂能够实现细胞的稳定传代培养，操作简单且成本低廉，同时采用栉孔扇贝担轮幼虫专用无钙海水等渗缓冲液浸泡与机械法结合的方式实现了对细胞的完全解离，无需经任何酶类的消化，该培养方法对栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的损伤小，成本低效率高，具有可重复性，本发明建立了一种稳定的海洋无脊椎动物细胞体外培养的方法，能够实现细胞的体外增殖和传代培养，是首个海洋贝类的连续细胞系，对除栉孔扇贝之外的其他贝类细胞建系具有重要的指导意义。

主权项

一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法，其特征在于，该培养方法包括以下步骤：将栉孔扇贝担轮幼虫细胞均匀分布在含有0.5毫升栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用高抗生素培养液的直径为35毫米细胞培养皿中，并放置到20～23℃的生化培养箱中培养，16～24小时后得到贴壁的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞，将体外培养细胞转移到体外培养细胞专用培养基中培养；根据栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基的颜色变化，每3～7天替换栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用培养基2毫升，当栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞形成克隆时，挑取出来实现早期传代；当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养；栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用高抗生素培养液中添加有2500‑25000单位/毫升青霉素、2500‑25000微克/毫升链霉素；所述栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基由L15基础培养基、5％胎牛血清、1％栉孔扇贝血清、2毫摩尔谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素构成；当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞传代培养的方法为：当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，用移液管轻轻吹打或用细胞刮刀刮取获得解离的单个细胞，再平均分散在两个细胞培养瓶中完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养；体外培养的细胞取自栉孔扇贝、担轮幼虫的细胞，同时该培养方法对其他贝类胚胎和幼虫细胞的培养具有指导意义。