预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法及应用

摘要

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法及应用。本发明通过以下步骤完成：1）扩增目的基因ClfA、ClfA及Sbi；2）构建pCI- Hla/ClfA-A/ Sbi-I-II真核重组表达载体；3）建立免疫程序及评估免疫效果。本发明基因工程疫苗是以迅速发展的分子生物学技术、遗传性、免疫学为基础，包括基因工程亚单位疫苗、基因突变疫苗、核酸疫苗等。核酸疫苗即DNA疫苗，是重组构建一种或多种抗原编码基因的真核表达载体，并将其直接注入机体而激活免疫系统，以达到预防和治疗疾病的目的。

主权项

一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法，其特征在于：1）设计引物根据Genebank上已经提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分别设计引物H1/H2、CA1/CA2和S1/S2，并加入相应的酶切位点：H1: GCGCTAGCATGAAAACACGTATAG                NheIH2: GCCTCGAGTTAATTTGTCATTTCTTCT              XhoICA1: GCCTCGAGGTAGCTGCAGATG                  XhoICA2:GCGAATTCCTCATCAGGTTGTTCAGGA            EcoRIS1:GCGAATTCACAAACAACTCAAAACAACTAC          EcoRIS2: GCTCTAGAATTTTGACGTTCTTTAGCTT             XbaI2）制备模板提取DNA模板所用的金黄色葡萄球菌分离自患临床乳房炎的奶山羊乳样，均匀涂抹乳样于血琼脂平板，37℃温箱中过夜培养，挑取溶血性菌于显微镜下观察细菌形态，确定为金黄色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液体培养基中，37℃摇床中培养过夜，取1 mL菌液，用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组DNA， ‑20℃保存备用；3）PCR扩增与回收目的基因（1）扩增目的基因Hla反应体系 50 μL：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，MgCl₂ 4 μL，H1/H2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀；PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火51.6℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min；（2）扩增目的基因ClfA的A区反应体系 50μL：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，MgCl₂ 4 μL，CA1/CA2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀；PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火52℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min；（3）扩增目的基因Sbi的I区和II区反应体系 50μL：超纯水32 μL，10×Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，MgCl₂ 4μL，S1/S2各1μL，模板2μL，Taq酶1μL，加样后充分混匀；PCR程序：预变性94℃ 5min；进入循环：变性94℃ 30s，退火51℃ 30s，延伸72℃ 1min，共30个循环；最终延伸72℃ 10min；（4）回收PCR扩增产物用胶回收试剂盒回收PCR扩增产物， ‑20℃保存备用；4）构建真核表达载体pCI‑ Hla/ClfA‑A/ Sbi‑I‑II（1）pCI‑Hla重组载体的构建用限制性内切酶Nhe I和Xho I分别对pCI、Hla在37 ℃温箱中酶切反应1 h，酶切产物经核酸电泳鉴定纯化后回收，然后将二者混合于16 ℃过夜连接，将连接产物转化入感受态细胞，在Amp⁺平板上37℃培养12 h后挑取阳性质粒做菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定；（2）pCI‑ Hla/ClfA‑A重组载体的构建用限制性内切酶Xho I和EcoR I分别对pCI‑Hla、ClfA‑A进行双酶切，方法同pCI‑Hla重组载体的构建方法；（3）pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II重组载体的构建用限制性内切酶EcoR I和Xba I分别对pCI‑ Hla/ClfA‑A、Sbi‑I‑II进行双酶切，方法同pCI‑Hla重组载体的构建方法；5）建立免疫程序及评估免疫效果选12只14~16 g的小鼠分两组，每组6只，分别用pCI质粒和重组的pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒以肌肉途径注射免疫，每三周免疫一次，最后一次免疫后第3周采集小鼠血清；IgG水平测定：用原核表达的ClfA的A区蛋白包被96孔板，37 ℃孵育2 h,加入小鼠血清，37 ℃共孵育2 h，最后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG的二抗37 ℃孵育1 h，酶标仪读取OD₄₅₀的值，结果表明pCI质粒免疫组的OD₄₅₀几乎为零，pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组的OD₄₅₀平均为1.6，说明pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组小鼠有较高的IgG水平；IgG1和IgG2a水平测定：方法同IgG水平测定，pCI质粒免疫组的IgG1和IgG2a的OD₄₅₀均为零，而pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组IgG1和IgG2a水平均在0.6~0.7之间，且IgG2a的量大于IgG1的量，说明经pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫的小鼠能产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答，并且细胞免疫应答强于体液免疫应答；保护效应评估：用100 μL 1 × 10⁶ /ml的金黄色葡萄球菌分别感染pCI质粒免疫组小鼠、pCI‑Hla/ClfA‑A/Sbi‑I‑II质粒免疫组小鼠的乳腺，24 h后取小鼠的乳腺组织，称重、捣碎后，将组织匀浆涂抹在琼脂平板上，37℃培养12 h后，计菌落数。