一种评价灵芝提取物质量的方法

摘要

本发明涉及一种评价灵芝提取物质量的新方法，该方法包括如下步骤：(1)体外抗氧化活性AOA的检测；(2)建立样品溶液的浓度与AOA的清除率的回归方程或关系曲线；(3)AOA的半数有效浓度EC₅₀的计算；(4)EC₅₀与参考标准值K_RV的比较；(5)灵芝提取物的质量评价。本发明通过建立系统的灵芝提取物的质量评价方法，直观地评价了不同灵芝提取物或灵芝产品在天然产物活性物质的活性差异和变化情况，克服了现有技术中只能针对灵芝中某一些成分对灵芝质量作出评价的局限性，将体外抗氧化活性作为评价灵芝提取物质量的一项通用的理化指标，并建立相对简单而直观的检测方法，能有效的、全面的评价灵芝提取物的质量。

主权项

一种评价灵芝提取物质量的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：(1)体外抗氧化活性AOA的检测：A、样品溶液的配制：称取灵芝提取物样品，溶解于80%甲醇溶液或重蒸水中配成灵芝提取物样品浓度为100‑5000µg/mL的样品溶液；B、样品溶液AOA的值的测定：所述的AOA的值包括：DPPH• 阳离子自由基清除能力‑AOA₁ 、ABTS^•+ 阳离子自由基清除能力‑AOA₂ 、超氧阴离子自由基清除能力或羟基阴离子自由基清除能力‑AOA₃ 、总抗氧化能力‑AOA₄ 和铁离子还原能力或亚铁离子螯合能力‑AOA₅ ；(2) 建立样品溶液的浓度与AOA的回归方程或关系曲线：根据步骤(1)中B得到的AOA的值，分别建立样品溶液的浓度与DPPH• 阳离子自由基清除能力、ABTS^•+ 阳离子自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力或羟基阴离子自由基清除能力、总抗氧化能力和铁离子还原能力或亚铁离子螯合能力五项AOA相应的回归方程或关系曲线；(3) AOA的半数有效浓度EC₅₀的计算：根据回归方程或关系曲线分别计算五项AOA的EC₅₀的值；(4) EC₅₀与参考标准值K_RV的比较：分别将EC₅₀值与相应的参考标准值K_RV比较，做出灵芝提取物的质量定性的初步评价；所述的参考标准值K_RV包括好‑趋向性指标为1、合格‑趋向性指标为0和不合格‑趋向性指标‑1，所述的好‑趋向性指标为1的K_RV值分别为：AOA₁<330，AOA₂<2200，AOA₃<870，AOA₄≤1400，AOA₅≤450；单位：µg/mL；所述的合格‑趋向性指标为0的K_RV值分别为：330≤AOA₁≤390，2200≤AOA₂≤2600，985≤AOA3≤1185,1600≤AOA₄≤1900，525≤AOA₅≤615；单位：µg/mL；所述的不合格‑趋向性指标为‑1的K_RV值分别为：AOA₁>390，AOA₂>2600，AOA₃>1185，AOA₄>1900，AOA₅>615；单位：µg/mL； (5) 灵芝提取物的质量评价：根据公式对灵芝提取物质量作出评价，所述的公式为：分项评价公式：M_i= (K_RVi－K_x)／K_RVi，其中，K_x是某项抗氧化活性AOAx，x=1~5的EC₅₀值，K_RV1为300µg/mL，K_RV2为2000µg/mL，K_RV3为870µg/mL，K_RV4为1400µg/mL，K_RV5为450µg/mL；_{质量评价公式：M=∑Mi，其中Mi的i值为1~5，根据质量评价公式计算出M值，按M值大小，将质量评价结果分为：好:M＞0.2、合格:0.2≥M≥－0.2、基本合格:－0.2＞M＞－1.5、不合格:M≤－1.5，根据Mi的正负可以进行定性判定。2. 根据权利要求1所述的一种评价灵芝提取物质量的方法，其特征在于：所述的样品溶液AOA的值的测定方法为：(1) DPPH• 阳离子自由基清除能力‑AOA1的测定：样品组：取样品溶液加入新鲜配制的0.2mmol/L DPPH甲醇溶液，室温25℃避光反应30min，所述的样品溶液与DPPH甲醇溶液两种溶液的体积比为1:1；空白对照组：用重蒸水代替样品溶液，其余同样品组；以80%甲醇溶液为空白调零，在517nm波长处分别测定样品组和空白对照组的吸光值，按公式 清除率= [1‑A1／A0] × 100% 计算清除率，平行测定三次取平均值，式中A0为空白对照组的吸光值，A1为样品组的吸光值；(2) ABTS^•+阳离子自由基清除能力‑AOA2的测定：ABTS^•+阳离子自由基溶液的制备：取7mmol/L的ABTS与2.45mmol/L的过硫酸钾等体积混合，23℃暗处反应12~16h，即得ABTS^•+阳离子自由基溶液；样品组：用80%乙醇稀释ABTS^•+阳离子自由基溶液，稀释后的溶液在30℃、734nm波长处的吸光值在0.7±0.02之间，得ABTS^•+工作溶液，取ABTS^•+工作溶液加入样品溶液中，摇匀后于23℃放置6min，所述的ABTS^•+工作溶液与样品溶液两种溶液的体积比为3.9:0.1；空白对照组：用80%乙醇代替样品溶液，其余同样品组；以80%甲醇溶液为空白调零，在734nm波长处分别测定样品组和空白对照组的吸光值，按公式清除率= [1－A1／A0] × 100%计算清除率，平行测定三次取平均值，式中A0为空白对照组的吸光值，A1为样品组的吸光值；(3) 超氧阴离子自由基清除能力或羟基阴离子自由基清除能力‑AOA3的测定：超氧阴离子自由基清除能力的测定：采用NBT还原法或邻苯三酚自氧化法测定超氧阴离子自由基清除能力；NBT还原法：样品组：取样品溶液，依次加入均由pH 7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液配制的156µmol/L NBT溶液和468µmol/L 还原性辅酶I溶液混匀，从加入由pH 7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液配制的60µmol/L吩嗪二甲酯硫酸盐PMS溶液开始计时，室温25℃反应5min，所述的样品溶液、NBT溶液、还原性辅酶I溶液和吩嗪二甲酯硫酸盐PMS溶液四种溶液的体积比为1:1:1:1；其中，样品对照组：用磷酸盐缓冲液代替NBT溶液；空白对照组：用80%甲醇溶液代替样品溶液，其余同样品组；并以80%甲醇溶液和磷酸盐缓冲液分别代替样品溶液和NBT溶液，进行空白调零，在560nm波长处分别测定样品组、样品对照组和空白对照组的吸光值，按公式清除率=[1－(A1－A2)／A0]× 100%计算清除率，平行测定三次取平均值，式中A0为空白对照组的吸光值，A1为样品组的吸光值，A2为样品对照组的吸光值；邻苯三酚自氧化法：样品组：取样品溶液加入pH 8.2的0.1mol/L Tris‑HCl 缓冲液，于25℃水浴20 min，加入25℃预热过的 10 mmol/L 邻苯三酚溶液，迅速混均后每隔30s在325 nm波长处测定样品组的吸光值，共测4 min，推迟30s后加入1滴 10mmol/L HCl 溶液中止反应并测定样品组的终止吸光值，所述的样品溶液、Tris‑HCl 缓冲液和邻苯三酚溶液三种溶液的体积比为1:4.5:0.5；空白对照组：用 10mmol/L HCl 溶液替代邻苯三酚溶液，其余同样品组；以重蒸水调零，按公式 清除率=[1－(ΔA0－ΔAx)／ΔA0]× 100%计算清除率，平行测定三次取平均值，式中ΔA0为空白对照组的吸光值在4 min的变化量；ΔAx为样品组加入样品溶液后的吸光值在4 min的变化量；羟基阴离子自由基清除能力的测定：样品组：依序加入等体积的9mmol/L FeSO4溶液、9mmol/L水杨酸‑乙醇溶液、样品溶液和9mmol/L过氧化氢溶液，于37℃反应30min；其中，样品对照组：用重蒸水代替水杨酸‑乙醇溶液；空白对照组：用重蒸水代替样品溶液；以重蒸水调零，在510nm波长处分别测定样品组和空白对照组的吸光值，按公式清除率＝[1－(A1‑A2)]／A0×100%计算清除率，平行测定三次取平均值，式中A0为空白对照组的吸光值，A1为样品组的吸光值，A2为样品对照组的吸光值；(4) 总抗氧化能力‑AOA4的测定：采用磷钼络合物法，样品组：取样品溶液加入反应液混匀得混合液，所述的样品溶液与反应液两种溶液的体积比为0.1:1，混匀后的混合液在95℃反应90min，冷却至室温，所述的反应液为0.6 mmol/L的硫酸、28mmol/L 的磷酸钠和4 mmol/L的钼酸铵；空白对照组：用80%甲醇溶液代替样品溶液调零，在695nm波长处分别测定样品组和空白对照组的吸光值，平行测定三次取平均值，以吸光值表示总抗氧化能力；(5) 铁离子还原能力或亚铁离子螯合能力‑AOA5的测定：铁离子还原能力的测定：采用普鲁士蓝法，样品组：取样品溶液加pH6.6的磷酸盐缓冲液和1%铁氰化钾溶液混匀后50℃水浴20min，然后加10%的三氯乙酸溶液，摇匀后静置10min得混合液，所述的样品溶液、磷酸盐缓冲液、铁氰化钾溶液和三氯乙酸溶液四种溶液的体积比为1:1:1:1；取混合液依序加重蒸水和0.1%氯化铁溶液，摇匀，静置10min，混合液、重蒸水和氯化铁溶液体积比为5:5:1；空白对照组：用80%甲醇溶液代替样品溶液；以重蒸水调零，在700nm波长处分别测定样品组和空白对照组的吸光值，平行测定三次取平均值，以吸光值表示还原能力；螯合亚铁离子能力的测定：样品组：取样品溶液依序加入0.1 mmol/L硫酸亚铁溶液，0.25 mmol/L菲洛嗪甲醇溶液混匀，暗处放置10 min，所述的样品溶液、硫酸亚铁溶液和菲洛嗪甲醇溶液三种溶液的体积比为1:1:1；其中样品对照组：用等体积重蒸水代替菲洛嗪溶液；空白对照组：用重蒸水代替样品溶液；以重蒸水调零，在562 nm波长处分别测定样品组和对照组的吸光值，按公式螯合率=[1－(A1－A2) /A0 ]×100%计算螯合率，式中A0为空白对照组吸光值，A1为样品组吸光值，A2为样品对照组吸光值。}