一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法

摘要

本发明一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，属于生物工程的动物生物技术，特别是水牛繁殖与定向遗传改良领域。所述方法包括：(1)、用于构建转基因克隆胚胎的转外源基因水牛胎儿成纤维细胞的制备；(2)、用于构建转基因克隆胚胎的受体卵胞质的制备；(3)、水牛转基因克隆重构胚的构建；(4)、水牛转基因克隆重构胚的培养。本发明的方法具有以下优点：用本发明的方法，成功获得了手工克隆水牛转基因胚胎，转基因克隆胚胎的囊胚发育率达到33.3％；相比于显微操作核移植方法，手工克隆无需昂贵仪器设配，简化了克隆的操作流程。

主权项

一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，包括下述步骤：(1)、用于构建转基因克隆胚胎的转外源基因水牛胎儿成纤维细胞(BFF)的制备；(2)、用于构建转基因克隆胚胎的受体卵胞质的制备；(3)、水牛转基因克隆重构胚的构建：步骤(2)的受体卵胞质与步骤(1)的转外源基因增强绿色荧光蛋白(EGFP)的水牛胎儿成纤维细胞供体细胞经植物凝集素作用粘合形成半卵‑供体‑半卵复合体；并采用一步融合法，通过100V/mm直流电波、脉冲时间10μs、2次脉冲进行电融合以构建得到采用手工克隆技术构建的水牛转基因克隆重构胚；(4)、水牛转基因克隆重构胚的培养：水牛转基因重构胚经5μmol/L离子霉素处理5min，再用2mmol/L的6‑二甲氨基嘌呤培养3h进行化学激活处理后，置于含有混合培养液的微穴中培养6‑7天，可获得发育到囊胚阶段的水牛转基因克隆胚胎，其中混合培养液是由RVCL液与SOF液以体积比1:1混合。