一种高效分离和测定草坪草内源激素的方法

摘要

本发明公开了一种高效分离和测定草坪草内源激素的方法，涉及植物内源激素的测定领域。本方法是：①通过加提取液浸提，然后离心、过滤、脱色，最后进行真空浓缩，完成內源激素的提取；②溶解内源激素获得溶解液，过96孔的固相萃取小柱逐步洗脱，将洗脱液真空浓缩，得固相萃取洗脱物；③将固相萃取洗脱物用流动相溶解，将流动相溶解液过滤后上高效液相色谱-质谱进样分析。本发明检测灵敏度高，选择性好，不需要衍生,实现了在植物样品的粗提取液中直接进行植物內源激素的检测；其分离提取方法、色谱分离条件和质谱检测方法适用于草坪草内源激素的测定，回收率高，达92～96%；可快速、准确同时分析4大类草坪草内源激素含量。

主权项

一种高效分离和测定草坪草内源激素的方法，其特征包括以下步骤：①内源激素的提取：通过加提取液浸提，然后离心、过滤、脱色，最后进行真空浓缩，完成內源激素的提取；②固相萃取洗脱：溶解内源激素获得溶解液，过96孔的固相萃取小柱逐步洗脱，将洗脱液真空浓缩，得固相萃取洗脱物；③高效液相色谱‑质谱分析：将固相萃取洗脱物用流动相溶解，将流动相溶解液过滤后上高效液相色谱‑质谱进样分析；所述的步骤①内源激素的提取：A、浸提：取0.5g鲜样，用液氮研磨，然后加提取液5ml，‑20℃提取过夜，得浸提液；所述的提取液即甲醇：甲酸：水＝15：1：4，按v/v，再加40mg/ml 2,6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚作为抗氧化剂；B、离心：将浸提液在15000转/min，4℃下离心10min，收集上清液置于新管并保存于‑20℃，残渣再用5ml提取液于‑20℃提取1h，离心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得离心液；C、过滤：将收集的离心液过20μm滤膜以去除残渣和较小的颗粒物，收集滤液，得过滤液；D、脱色：先用1ml 100％甲醇和1ml 1mol/L甲酸平衡C18固相萃取柱，然后将过滤液通过置于真空抽滤装置上的96孔C18固相萃取小柱，并连接上真空泵，以1ml/min的速度抽滤，以去除色素和脂类物质；过小柱后，收集滤液，再用1ml的样品提取液洗脱小柱中的样品并收集滤液，得脱色滤液；F、真空浓缩：将收集的脱色滤液置于真空浓缩仪中，于40℃浓缩至完全干燥，即完成内源激素的提取；所述的步骤②固相萃取洗脱：A、用2ml 1mol/L甲酸溶解沉淀，得甲酸溶解液；B、分别用1ml 100％甲醇和1ml 1mol/L甲酸平衡96孔的混合型阳离子交换反相固相萃取小柱，然后将甲酸溶解液过小柱以吸附激素，弃滤液；C、用1ml的1mol/L甲酸洗柱后，用2ml甲醇洗柱，收集滤液，该收集液中含有脱落酸、生长素和赤霉素三类激素；D、用2ml 0.35mol/L的氨水冲洗小柱，弃滤液；E、用2ml 60％甲醇配制的0.35mol/L的氨水洗柱，收集滤液，该收集液中含有细胞分裂素Z、ZR、DHZ、DHZR、iP和iPA；F、将洗脱液置于真空浓缩仪中40℃浓缩至完全干燥；G、过程B至E需将96孔的混合型阳离子交换反相固相萃取柱置于真空抽滤装置上并连接真空泵，以1ml/min的速率进行抽滤，以提高洗脱效率；所述的步骤③高效液相色谱‑质谱连用分析：A、将真空浓缩获得的沉淀用200～500μl流动相溶解，得流动相溶解液；B、用一次性医用注射器吸取流动相溶解液过0.22μm滤膜后装至进样瓶中，上液相色谱‑质谱进样分析；C、如样品量过少，样品装入带内撑管的进样瓶中进行上机分析；D、液相色谱条件为：色谱柱为安捷伦Zorbax SB‑C18液相色谱柱，柱温为30℃，流速为200μl/min，紫外检测波长为265nm，进样量为10μl；脱落酸ABA，赤霉素GA3，生长素IAA、IBA的流动相按时间min、流动相A 0.1％甲酸水、流动相B 100％甲醇分别为：0、70％、30％；3、70％、30％；10、30％、70％；15、30％、70％；20、5％、95％；25、5％、95％；28、70％、30％；35、70％、30％；细胞分裂素Z，ZR，DHZ，DHZR，iP，iPA的流动相按时间min、流动相A 0.1％甲酸水、流动相B 100％甲醇分别为：0、80％、20％；5、80％、20％；10、55％、45％20、55％、45％；35、5％、95％；50、5％、95％；50.1、80％、20％；55、80％、20％；E、质谱条件为：质谱仪为TSQ Quantum Access MAX三重四极杆质谱仪；离子源选择ESI源，离子检测模式选择MRM，电喷雾电压为3500V，质谱扫描范围50～600m/z，扫描速度22000m/z/s；內源激素离子及碰撞能量按激素、母离子、子离子、碰撞能量、离子模式分别为：ABA、263.125、153.161、14V、负离子；GA3、345.152、143.185、39V、正离子；IAA、176.108、103.265、31V、正离子；IBA、204.118、130.16、29V、正离子；Z、220.13、119.221、41V、正离子；ZR、352.245、136.004、29V、正离子；DHZ、222.148、136.167、20V、正离子；DHZR、354.24、95.153、80V、正离子；iP、204.15、136.187；22V；正离子；iPA、336.203、204.329、17V、正离子。