大规模制备肝干细胞的方法与用途

摘要

本发明涉及一种肝干细胞的大规模制备的方法及其在细胞移植、干细胞培养、扩增、定向分化和组织器官形成领域的用途。本发明所述的肝干细胞的制备方法，包括以下步骤：从动物或人肝组织中采用机械法、酶法和机械-酶法和密度梯度离心法，联合提取肝干细胞；体外大规模培养，扩增，经肝干细胞鉴定后冻存备用。此方法比常规方法制备肝干细胞效率提高约100-10000倍，可用于组织工程学，肝干细胞制剂或干细胞药物的生产，以达到为人类疾病提供一种新的治疗手段。

主权项

一种规模化制备肝干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、称取幼年动物或胚胎肝组织，加入10至100倍体积的0.1M/L PBS缓冲液，采用机械法剪碎，绞碎或匀浆；B、离心，去上清，沉淀用0.001%‑1%胶原酶37℃搅拌4℃‑37℃消化10分钟至24小时，收集细胞，细胞计数和存活率检测；用10至100倍体积的0.1M PBS缓冲液洗涤1～3次，离心，去上清，沉淀用0.001%‑2.5%的胰酶4℃‑37℃消化10分钟至24小时，收集细胞，细胞计数和存活率检测；C、用10‑100倍体积的0.1M PBS缓冲液将沉淀洗出，加0.001%‑1%胶原酶、0.001%‑0.5%蛋白酶K、0.0001%‑0.05%DNase继续搅拌4℃‑37℃消化10分钟至24小时，0.1M PBS缓冲液洗涤3次，沉淀用10‑100倍体积的0.1M PBS缓冲液洗出上层悬浮细胞，过滤，离心后进行细胞计数和存活率检测；D、50ml离心管中加入比重为1.120的肝干细胞分离液，取上述细胞按1×10⁷/ml细胞悬浮液约10ml‑20ml，小心加至分离液之上，离心，取分离液与上清液界面的细胞，用0.1MPBS缓冲液洗涤3次，细胞计数；E、用比重为1.070‑1.077的淋巴细胞分离液纯化肝干细胞；F、取上述细胞按1×10⁵/ml进行培养，培养基为DMEM/F12培养基，内加bFGF、EGF和胎牛血清，当细胞长满约90%密度培且细胞生长为三角样细胞后，采用胰酶消化法收集肝干细胞，传代，接种密度为1×10⁵/ml继续培养；G、加入贴壁材料或磁珠，采用摆瓶法或转瓶法进行大规模细胞扩增，同时保持肝干细胞未分化；H、当细胞扩增10‑10000倍后收集细胞，经检测符合肝干细胞的特征，按1‑2×10⁷/ml进行细胞冻存，备用。