一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法

摘要

本发明涉及一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒BmNPV复制非必需基因的方法，所述方法以BmNPV为材料，通过PCR对其一个复制非必需片段两端的同源序列进行扩增并克隆至载体pUC19中；通过重叠PCR法依次拼接BmNPV的IE1早期启动子、标记基因(EGFP)、终止序列SV40polyA，并克隆至上述载体pUC19获得重组转移载体pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64；将该载体与野生BmNPV的基因组共转染BmN细胞，经同源重组获得带有荧光标记的重组病毒RBmNPV-EGFP；将其基因组DNA与不带有标记基因的转移载体pUC19-lef7-gp64共转染BmN细胞，通过同源重组获得不带有荧光标记基因的重组病毒RBmNPV。本发明解决了重组病毒基因组中带有标记基因的问题，提高了阳性重组病毒的筛选效率，且此标记基因可以被反复利用。

主权项

一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1) 抽提家蚕核型多角体病毒BmNPV基因组， 通过PCR方法获得复制非必需片段两端的同源序列LEF7、gp64；(2)将步骤(1)所得的同源序列lef7、gp64依次克隆至转移载体pUC19‑IE1‑EGFP‑SV40polyA中，获得重组转移载体 pUC19‑lef7‑IE1‑EGFP‑SV40polyA‑gp64，并与家蚕核型多角体病毒基因组通过脂质体介导转染法共转染BmN细胞，经同源重组获得带有EGFP标记的重组病毒RBmNPV‑EGFP；(3)提取重组病毒RBmNPV‑EGFP的基因组与无标记基因的转移载体pUC19‑lef7‑gp64共转染BmN细胞；(4)筛选无标记基因的重组病毒RBmNPV。