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一种用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法，具体包括以下步骤：（1）设计微生物勘探指示菌特异性探针利用软件收集分析上述微生物的特异性序列，设计油藏微生物勘探指示菌属特异性探针，芯片上的条码序列探针序列结构通式为：NH2‑TTTTTTTTTTTTTTT‑条码序列，即探针的5′端氨基修饰，氨基旁边连接poly‑T15。（2）制备芯片使用点样仪将探针以设定的顺序固定到醛基化修饰的玻片上，芯片是由微生物勘探指示菌探针、QC（点样的阳性质控）、BC（点样的阴性质控）、NC（杂交的阴性质控）和PC（杂交的阳性质控）组成的阵列。所有的条码序列探针用50%DMSO溶解，终浓度为10μM，每个点重复三次点制到玻片上，封闭芯片上未与寡核苷酸结合的醛基，QC为一端带有Hex标记，另一端氨基修饰的寡核苷酸探针，用于观察芯片点样和固定的效率，其序列为NH2‑TTTTTTTTTTTTTTTAGAGTGCTTGGTGCCATAAC‑HEX；BC为50％的DMSO，用于质控点样过程中有无样品残留污染；NC是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，与杂交液中的所有待检测序列不会杂交，用于观察有无非特异杂交，其序列为NH2‑TTTTTTTTTTTTTTTGCAACCACCACCGGAGG；PC是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，可以与杂交液中添加的荧光标记的互补序列（c‑PC）杂交，用于杂交过程的质控，其序列为NH2‑TTTTTTTTTTTTTTTGGTATCGCGACCGCATCCCAATCT。（3）核酸扩增分别以油藏样品基因组DNA为模板，用上游引物和下游引物PCR扩增；扩增体系如下,包括0.1‑0.3mM dNTPs,1×Qiagen PCR buffer,添加MgCl<sub>2</sub>至1‑3mM,pH8.7,05.‑2单位DNA Polymerase，和0.05‑0.3ng模版DNA，上下游引物，25μl扩增体系中，引物的浓度为0.01‑0.04μM。扩增参数为：先95℃15分钟；然后94℃30秒,50‑65℃1分钟，72℃30‑90秒，30‑40个循环；最后72℃6‑15分钟；4℃保存。（4）基因芯片杂交取5‑20μl PCR产物加到两倍体积杂交缓冲液中(6×SSC,5×Denhardt′s reagent,25％甲酰胺,0.1%SDS,5nM c‑PC（与芯片PC互补的序列，5′端TAMRA标记），95‑98℃变性3‑10分钟，冰浴,杂交混合物加入到点阵中反应，然后将芯片放置36‑45℃水浴中杂交0.5‑3小时，取出玻片分别在两种洗液中36‑45℃各洗1‑5min，洗液Ⅰ：0.1‑0.5×SSC/0.05‑02%SDS，洗液II：0.01‑0.1×SSC，最后，玻片稍离心甩干。（5）数据分析使用芯片扫描仪扫描芯片，根据荧光信号强度及扫描图像分析目的油藏古菌群落结构。 |
