一种用PEG/Na₂SO₄双水相萃取发酵液丁酸的方法

摘要

本发明涉及一种用PEG/Na₂SO₄双水相萃取发酵液丁酸的方法。本发明采用如下技术方案：一种用PEG/Na₂SO₄双水相萃取发酵液丁酸的方法，其特征在于：包括有以下步骤，一、发酵液盐析除杂，二、PEG／Na₂SO₄双水相系统建立，三、萃取发酵液丁酸单因素实验，四、响应面优化实验，五、多级萃取，六、PEG回收，七、蒸馏分离丁酸，通过采用上述步骤，本发明针对现有技术存在的不足，提供一种，具有低能耗、操作简单、重复利用萃取剂等优点的新型的用PEG/Na₂SO₄双水相萃取发酵液丁酸的方法。

主权项

一种用PEG/ Na₂SO₄双水相萃取发酵液丁酸的方法，其特征在于：包括有以下步骤，一、发酵液制备及预处理，丁酸菌种为本实验室保存，培养基：葡萄糖32‑38 g /L，蛋白胨3‑7g /L，酵母膏3‑7g /L，( NH₄)₂SO₄ 1.5‑2.5 g /L，FeSO₄·7H₂O 0.5‑0.9 g /L ，K₂HPO₄ 1‑5g /L，发酵温度为30‑38 ℃，搅拌转速120‑170 r/min，pH 值5‑6，采用葡萄糖补料流加，初始葡萄糖质量浓度为32‑38 g/L，当糖质量浓度降至8‑12 g /L 时，补料至糖质量浓度为32‑38 g/L，按上述操作重复补料发酵至产物质量浓度不再提高，底物不再消耗时，停止发酵实验，将发酵液于4000‑6000r /min 离心8 min以上，除去菌体及其他固形物，上清液即为发酵液；二、发酵液盐析除杂，发酵液中加入硫酸钠使发酵剩余的糖类和含氮化合物产生沉淀，过滤后将滤渣洗涤两次以上，取得的滤液加入PEG形成双水相；三、 PEG／Na₂SO₄双水相系统建立，利用Albertsson浊点法滴定法测定双水相相组成，在280K‑300K的水浴锅中进行滴定操作，测定并制作由PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000与Na₂SO₄溶液形成的各体系相图，称取一定量的 35‑45％质量浓度 的PEG溶液于烧杯中，定量滴加35‑45％质量浓度的Na₂SO₄溶液，振荡，滴至混合物体系出现浑浊状态，显示已形成不溶的两相，按照式(1)和式(2)算出此时PEG和Na₂SO₄在系统中的质量分数，即得相图中的一个点，（1）（2）式中 p——在某单相点时硫酸钠在系统中的总量，g；q——在某单相点时PEG在系统中的总量，g；w——在某单相点时水在系统中的总量，g；a——在某单相点时硫酸钠的质量分数，％ ；b——在某单相点时PEG的质量分数，％；四、萃取发酵液丁酸单因素实验，取丁酸发酵液，根据步骤三的成相规律加入3.5‑4.5倍丁酸发酵液的PEG和硫酸钠，混合均匀，恒温下静置分相，成相后分别取上下相液体，以丁酸在双水相的上相中的得率为指标，采用气相色谱Agilent GC6820 测定丁酸质量分数，色谱参数为：HP‑INNOWAX 毛细管柱；FID 检测器；载气：高纯氮；进样口温度220‑270 ℃，FID 检测器温度220‑270 ℃；采用外标法，进样量0.3‑0.5 μL；丁酸的出峰时间分别为1.4‑1.7min，物质的含量由峰面积与标准曲线计算，上述公式中，Y为丁酸在上相中的萃取率；C₁、C₂为双水相体系中下相丁酸的质量浓度，单位为mg/mL ；V₁、V₂ 为双水相系统上、下相体积，单位为mL；五、响应面优化实验，根据Box‑Behnken的中心组合试验设计原理，综合单因素实验结果，选取对丁酸在双水相中分配行为影响较大的三个因素，分别用X₁，X₂，X₃代表，其中X₁为PEG6000的质量，X₂为Na₂SO₄浓度，X₃为温度，以丁酸在上相中的得率为响应值(Y)进行实验；六、多级萃取，发酵液经一次萃取，下相中还含有较多的丁酸，把下相放入双水相再进行萃取，合并多级的上相萃取液，可得到较高的丁酸萃取率；七、PEG回收，收集的双水相上相洗脱液加入碘溶液,使PEG沉淀，过滤沉淀；八、 蒸馏分离丁酸，根据丁酸和乙酸的沸点不同，通过蒸馏分离得到纯的丁酸。