一种石斛多糖含量的测定方法及其应用

摘要

本发明公开了一种测定石斛多糖含量的方法及其应用。本发明采用热水浸提法提取石斛粗多糖、采用Sevag法和透析法脱蛋白获得石斛精多糖，通过测定一种石斛的换算因子，依据此换算因子测定其他不同来源的石斛多糖的含量，不需要重新制备粗多糖和精多糖，能有效地降低材料的使用成本，并能够批量的测定多种石斛的多糖含量，使石斛多糖的检测更为方便、简捷、科学。本发明得到的石斛精多糖纯度高、杂质少；与现有超声波提取、酸碱提取等方法相比，本发明的测定方法能够精确地检测石斛多糖的含量，给石斛品种的鉴定提供参考，也给石斛育种、生产和市场消费提供有效的指引。

主权项

一种石斛多糖含量的测定方法，其特征在于包括以下步骤：(1)标准曲线的制备：分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0ml的0.05mg·mL^‑1的葡萄糖标准液，各加蒸馏水补至2.0ml，然后各加6wt％重蒸苯酚1.0ml，摇匀后加入98wt％浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度；以吸光度为纵坐标、葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程；(2)换算因子的测定：取50μg·ml^‑1石斛精多糖溶液0.05～1ml，加蒸馏水补足至2.0ml，加6wt％重蒸苯酚溶液1.0ml，摇匀后加入98wt％浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度，根据回归方程计算石斛精多糖溶液中葡萄糖的浓度；计算换算因子f：f＝Cs/C，其中，Cs为石斛精多糖溶液的实际浓度，C为回归方程计算石斛精多糖溶液中葡萄糖的浓度；(3)石斛多糖含量的测定：吸取石斛样品溶液0.05～1ml，加蒸馏水补至2.0ml，然后加6wt％重蒸苯酚1.0ml，摇匀后加入98wt％浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度，由回归方程计算石斛样品溶液中葡萄糖的浓度，由下述公式计算石斛多糖含量X：X＝f×C’×D×100％/W；式中：f‑‑换算因子，C’‑‑由回归方程得到的石斛样品溶液中的葡萄糖含量，D‑‑石斛干燥粉末测定中的稀释倍数，W‑‑石斛干燥粉末的质量；步骤(3)中所述的石斛样品溶液采用以下方法进行制备：将石斛粉末按质量体积比1g/100～150ml加入80wt％乙醇中，80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤渣；往滤渣中按质量体积比1g/100～150ml加入蒸馏水，80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤液，合并滤液，用蒸馏水定容至50mL，摇匀，得到石斛样品溶液；步骤(2)中所述的石斛精多糖采用以下方法进行制备：取石斛粉末，按质量体积比1g/10～15ml加入石油醚，80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤渣A；按质量体积比1g/10～15ml往滤渣A中加入80wt％乙醇，80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤渣B；于60℃将滤渣B烘干，得到脱脂干粉；按质量体积比1g/10～15ml往脱脂干粉加入蒸馏水，80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤液，合并滤液，浓缩，收集浓缩液；往浓缩液中加入预冷无水乙醇至溶液含醇量为80wt％，静置过夜，离心，收集沉淀，干燥，得到石斛粗多糖；取石斛粗多糖，配制成40mg·ml^‑1的石斛粗多糖溶液；往40mg·ml^‑1石斛粗多糖溶液中加入1mg·ml^‑1的胰蛋白酶，得到混合液，所述的混合液中，胰蛋白酶和粗多糖溶液体积比为0.4：1；37℃恒温处理5h后于95℃灭活5min，加入Sevag溶液，常温振荡培养5min后于10℃、3500rpm离心5min，保存上层溶液，取下层溶液，加入Sevag溶液，重复振荡培养和离心操作3次，合并上层溶液，用蒸馏水过夜透析后加入4℃预冷无水乙醇至溶液含醇量为80wt％，静置过夜，离心，收集沉淀、干燥，得到石斛精多糖。