木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系

摘要

本发明涉及木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系，属于生物技术领域。将XynB基因插入真核表达载体pcDNA3.1(-)，并构建慢病毒重组载体Lanti4-blockit-RELMβ-XynB-myc-GFP，转染原代培养的猪胎儿成纤维细胞，构建肠道定向表达XynB酶蛋白的真核细胞系。为进一步开展体细胞核移植克隆转XynB基因胚胎，培育高饲料利用率、低污染物排放的转基因猪新品种及其相关生物学科研与生产领域提供必要的转基因生物材料和关键技术体系支撑。

主权项

木聚糖酶肠道定向表达载体，是通过以下方法构建而成的：(1)以原核载体pRSETA‑XynB为模板，根据XynB基因序列，设计PCR引物P1和P2，P1引物5’端引入Xho I酶切位点，在酶切位点与起始位点之间引入Kozak序列GCCACC，P2引物5’端引入Kpn I酶切位点和Myc‑Tag序列CAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTC：P1: 5’‑CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT‑3’Xho IP2:5’‑GGGGTACCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTGAACAGTGATGGA‑3’ Kpn IPCR 扩增条件为：98℃，5min；98℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；32个循环；72℃，5min，PCR扩增片段大小为678bp；将上述PCR终产物与pMD18T连接，得到克隆载体pMD18T‑XynB‑Myc；(2)将上述克隆载体pMD18T‑XynB‑Myc用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，同时用相同限制性内切酶双酶切pcDNA3.1(‑)，将酶切回收的XynB‑Myc目的片段和pcDNA3.1(‑)载体片段由T4 DNA连接酶4℃连接过夜，得到XynB真核表达载体pcDNA3.1‑XynB‑Myc；(3)根据XynB基因及GFP基因序列，设计PCR反应引物 P3 / P4 和 P5 / P6，引物 P3/P4 扩增 XynB‑Myc，引物 P5/P6 扩增 GFP，P4有部分序列与GFP基因互补，P5有部分序列与XynB‑Myc基因片段互补，P6引物5’端引入终止密码子TAA；P3: 5’‑CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT‑3’Xho IP4: 5’‑CCTTGCTCACCATAGATCCTCTTCT‑3’P5: 5’‑GAAGAGGATCTGATGGTGAGCAAGGG‑3’P6: 5’‑GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA‑3’Kpn I以pMD18T‑XynB‑Myc载体为模板，使用引物P3/P4，扩增XynB‑Myc片段，大小为682bp；以质粒pEGFP‑C3为模板，使用引物P5/P6，扩增GFP片段，大小为768bp；以上述扩增产物XynB‑Myc片段及GFP片段为模板，用引物P3和P6，采用重叠PCR方法将两种组件融合，得到XynB‑Myc‑GFP片段，该融合片段的大小为1398bp，扩增程序为98℃，5min；98℃，30s；52℃，30s；72℃，90s；32个循环；72℃，10min；将上述PCR终产物XynB‑myc‑GFP片段与pMD18T 在4℃条件下连接，获得重组载体pMD18T‑XynB‑myc‑GFP；(4)将中间载体pMD18T‑XynB‑myc‑GFP用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，同时用同样的限制性内切酶双酶切pcDNA3.1(‑)，将酶切回收的XynB‑myc‑GFP目的片段和pcDNA3.1(‑)载体片段采用T4 DNA连接酶4℃连接过夜，获得真核表达载体pcDNA3.1(‑)‑XynB‑myc‑GFP；（5）猪RELMβ基因启动子区目前未见报道，猪和人基因同源性极高，根据Genebank中人RELMβ基因5’侧翼区序列AF352731，猪RELMβ基因cDNA序列NC_010455，按照5’端递减原则，设计PCR正向引物P7‑P12，引物5’端引入NheⅠ酶切位点，反向引物P13，引物5’端引入XhoⅠ酶切位点，扩增不同长度猪RELMβ启动子片段：　序列5´‑3´目的片段大小/bpP7(‑842～+215)CTAGCTAGCGAACTTATGACCATGAGGAC1048P8(‑793～+215)CTAGCTAGCGATGAAGAGCCACTGAAC1017P9(‑574～+215)CTAGCTAGCAAATATGGCCCTAACTCAAC798P10(‑182～+215)CTAGCTAGCCTCCCCGATTCTCAAAAC406P11(‑147～+215)CTAGCTAGCGCTCCTCCATTCTGACAC371P12(‑86～+215)CTAGCTAGCTCTTTCCTTCCCAGCAAC310P13CCGCTCGAGATAATCAGACTGCTCAC　（6）上述扩增得到的RELMβs启动子片段连接到pMD18T载体，构建中间载体pMD18T‑RELMβs，pGL3‑Enhancer载体和上述获得的pMD18T‑RELMβs分别经NheⅠ和XhoⅠ双酶切、凝胶回收，使用T4 DNA连接酶4℃过夜连接，将RELMβs定向克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3‑Enhancer中，利用双酶切和测序方法，筛选构建正确的重组pGL‑RELMβs基因启动子荧光素酶报告质粒；（7）分别接种人胚肾293T细胞和人结肠腺癌细胞HT29于96孔板，用含有10%胎牛血清、青霉素100 U/ml和链霉素100 U/ml的DMEM培养基，37℃、5% CO₂条件下培养，当细胞生长至汇合率70‑80%时，采用脂质体Lipo LTX转染，将构建的pGL‑RELMβs‑Enhancer系列缺失片段荧光素酶报告载体转染HT29细胞，同时转染pGL3‑basic为阴性对照组，pRL‑TK为内参质粒；双荧光素酶活性检测，筛选启动子活性最高片段；（8）双荧光素酶活性检测结果显示，RELMβ启动子‑574～+215区域活性最强，以引物P9和P13扩增RELMβ启动子片段并克隆到pMD18T载体上，获得重组载体pMD18T‑RELMβ；采用Nhe I和Xho I进行双酶切，凝胶回收，T4 DNA连接酶4℃过夜连接，将RELMβ片段克隆到pcDNA3.1‑XynB‑myc‑GFP相应的酶切位点，获得木聚糖酶肠道定向表达载体pcDNA3.1‑RELMβ‑XynB‑myc‑GFP。