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一种测定与已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列的方法，所述方法包括：(a)将包含所述已知靶核苷酸序列的靶核酸与通用寡核苷酸尾部接头连接；(b)用第一接头引物和第一靶特异性引物扩增所述靶核酸的一部分和所述通用寡核苷酸尾部接头的扩增链；(c)用第二接头引物和第二靶特异性引物扩增由步骤(b)产生的扩增子的一部分；(d)使用第一测序引物和第二测序引物对由步骤(c)产生的扩增部分进行测序；其中，所述通用寡核苷酸尾部接头包含第一可连接双链末端和第二未配对末端；其中，所述通用寡核苷酸尾部接头包含封闭链和扩增链；其中，所述封闭链包含5’双链部分；其中，所述扩增链包含未配对5’部分、3’双链部分和3’T突出；其中，所述扩增链包含与第一测序引物和第二测序引物相同的核酸序列；其中，所述封闭链和所述扩增链的双链部分基本上互补，并形成包含3’T突出的所述第一可连接双链末端；其中，所述双链部分足够长，以在连接温度下维持双链形式；其中，所述第一靶特异性引物包含能在退火温度下特异性退火至所述靶核酸的所述已知靶核苷酸序列的核酸序列；其中，所述第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分含有能特异性退火至由步骤(b)产生的扩增子所包含的所述已知靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分含有与第二测序引物相同的核酸序列，并且所述第二靶特异性引物相对于所述第一靶特异性引物嵌套；其中，所述第一接头引物包含与所述第一测序引物的5’部分相同的核酸序列；以及其中，所述第二接头引物包含与所述第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且相对于所述第一接头引物嵌套。 |
