四糖MAG拮抗剂的合成方法

摘要

本发明公开了一种化学酶法合成双唾液酸化的四糖拮抗剂的合成方法。本发明还提供了两种用于合成制备四糖MAG拮抗剂的中间体，分别为通式Ⅳ、Ⅴ所示的化合物。本发明将化学合成法的灵活性和酶合成法的区域选择性和高效性结合到一起，解决了目前化学合成双唾液酸化四糖拮抗剂的所面临的底物反应活性低、合成步骤繁多、收率低，以及酶法中唾液酸转移酶获得困难和只对糖肽的识别等不足，具有底物反应活性高、收率高的优点。因而，本发明为在分子水平上研究唾液酸类拮抗剂与髓磷脂相关糖蛋白之间相互作用具有重要意义。

主权项

四糖MAG拮抗剂的合成方法，其特征在于：所述步骤如下：(1)利用化学法合成β‑构型的N‑乙酰氨基半乳糖苷，结构如通式Ⅰ所示，其中R1为叠氮取代烷基；其中，β‑构型的N‑乙酰氨基半乳糖苷采用以下方法合成：将半乳糖氨盐酸盐与醋酐进行反应后，将其全部羟基用乙酰基保护；然后在微波条件下进行β‑构型糖苷化反应，然后依次叠氮化和脱保护后即得；(2)利用“一锅双酶法”将通式Ⅰ和半乳糖立体选择性偶联合成二糖Gal(l‑3)GalNAcOR 1，结构如通式Ⅱ所示，所述“一锅双酶法”中先后用到的酶分别为半乳糖激酶和己糖磷酸化酶；其中：R1为叠氮取代烷基；其中，二糖Galβ(l‑3)GalNAcΟR 1合成方法是：将化合物Ⅰ、1.5‑3.0当量的半乳糖、1.5‑5.0当量的腺嘌呤核苷三磷酸、5‑100mmol的MgCl₂、10‑500mmol、pH 5.0‑10.0的Tris‑HCl缓冲液配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5‑8.5，然后添加半乳糖激酶和己糖磷酸化酶，待反应完成后，纯化即可直接获得二糖化合物Ⅱ；(3)利用“一锅双酶法”唾液酸化合成α2,3唾液酸化三糖，结构如通式Ⅲ所示，所述“一锅双酶法”唾液酸化中用到的酶指CMP‑唾液酸合成酶和α2,3唾液酸转移酶，其中：R1为叠氮取代烷基，R2为氮乙酰氨基，R3为叠氮；其中，α2,3唾液酸化三糖的合成方法：将化合物Ⅱ、1.5‑5.0当量的唾液酸衍生物、0.5‑10.0当量的胞苷三磷酸、5.0‑100mmol的MgCl₂和10‑500mmol、pH 5.0‑10.5的Tris‑HCl缓冲液配制水溶液，加入CMP‑唾液酸合成酶和α2,3唾液酸转移酶，实现“一锅双酶法”唾液酸化，反应完成后，纯化即可直接获得化合物Ⅲ；(4)利用乙酰化和选择性脱乙酰基的方法，合成含唾液酸衍生物的内酯三糖，结构如通式Ⅳ所示，其中，R1为叠氮取代烷基，R2为氮乙酰氨基，R3为叠氮；含唾液酸衍生物的内酯三糖合成方法是：在冰浴的条件下，加入化合物Ⅲ、吡啶、醋酐，反应5‑24小时后旋蒸蒸干，拌入硅胶，柱分离纯化，得到全乙酰化的化合物Ⅳ；之后将全乙酰化的中间体溶于甲醇，加入甲醇钠粉末，使反应体系的pH值保持在7‑9，反应5‑10小时，然后柱分离纯化即得化合物Ⅳ；(5)利用酶法双唾液酸化合成双唾液酸化四糖的内酯，所述酶法唾液酸化中用到的酶指α2,6唾液酸转移酶，结构如通式Ⅴ所示；其中：R1为叠氮取代烷基，R2为氮乙酰氨基，R3为叠氮，R4为羟基，R5为氮乙酰氨基；双唾液酸化四糖的内酯的合成方法是：将化合物Ⅳ、1.5‑5.0当量的CMP‑唾液酸衍生物、5.0‑100mmol的MgCl₂和10‑500mmol、pH 5.0‑10.5的Tris‑HCl缓冲液配制水溶液，加入α2,6唾液酸转移酶，实现酶法唾液酸化，反应完成后，纯化即可直接获得化合物Ⅴ；(6)碱性水溶液中水解上述双唾液酸化四糖的内酯，得到四糖MAG拮抗剂，结构如通式Ⅵ所示；其中：R1为叠氮取代烷基，R2为氮乙酰氨基，R3为叠氮，R4为羟基，R5为氮乙酰氨基；化合物Ⅵ的合成方法是：将化合物Ⅴ溶于0.1‑1mol的氢氧化钠水溶液中，反应2‑12小时，纯化即可直接获得化合物Ⅵ；所述步骤(2)和步骤(3)中“一锅双酶法”合成中反应温度为0‑37℃，转速为0‑240rpm；酶反应的停止方法是向反应体系中加入与反应液等体积的4℃无水乙醇并在4℃下培育0‑30分钟。