以花丝为外植体诱导萱草红朗姆愈伤组织的方法

摘要

本发明提供一种以花丝为外植体诱导萱草“Red Rum”愈伤组织的方法，包括外植体的采集与灭菌、花丝的获得与接种、愈伤组织的诱导培养、继代增殖培养和生根培养的步骤。本发明解决了目前萱草分株繁殖效率低、周期长的缺点，且与常规的以花茎作为外植体的组培方法相比，具有取材量更大、节约成本、灭菌效果好、愈伤组织诱导效率更高的优点，其诱导率比花茎的诱导率高出一倍左右。本发明的方法可以为以萱草花丝为基础的其他研究（例如体细胞胚的培养）等提供相关的技术支持。

主权项

以花丝为外植体诱导萱草“Red Rum”组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)外植体的采集与灭菌：采集长度为1.0～2.5cm的生长发育正常的萱草‘Red Rum’花蕾，用毛笔蘸取低浓度的洗洁精溶液进行初步的表面清洁，然后用水冲洗，依次置于75％～85％酒精中10～20s，1％NaClO溶液中8～15min，进行灭菌，获得无菌花蕾；2)花丝的获得与接种：在无菌环境下，切除上述无菌花蕾底部花托部分，剖开花被，取出花丝，同时去除花丝下部与花托相连接的部分以及花丝上部与花药相连接的部分，取中段的花丝作为外植体；将作为外植体的花丝的形态学下端向下接种到诱导培养基中培养，将花丝下部约1/3的部分插入培养基中；3)愈伤组织的诱导培养：上述诱导培养基为MS+1.0mg/L 6‑苄基嘌呤+0.5mg/L二氯苯氧乙酸+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH值6.15，培养至愈伤组织出现；4)继代增殖培养：将愈伤组织转移至增殖培养基中，进行增殖培养，每隔28～30天继代一次，继代一至三次；5)生根培养：将继代增殖后生长良好的组培幼苗去除愈伤组织后转入空白MS培养基中培养两周后，再转入生根培养基中进行生根培养；步骤3)‑5)中培养条件为：23±1℃，光照强度2000～3000Lx，光照周期16/8h；步骤4)中使用的增殖培养基为：MS+1.0mg/L 6‑苄基嘌呤+0.01mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH值6.15；或MS+2.0mg/L6‑苄基嘌呤+0.01mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH值6.15；步骤5)中使用的生根培养基为：1/2MS+0.1mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂；所述MS培养基为：大量元素：NH₄NO₃1650mg/L、KNO₃1900mg/L、CaC1₂·2H₂O440mg/L、MgSO₄·7H₂O 370mg/L、KH₂PO₄170mg/L；微量元素：KI 0.83mg/L、H₃BO₃6.2mg/L、MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂08.6mg/L、Na₂MnO₄·2H₂O 0.25mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L、CoC1₂·6H₂O 0.025mg/L；铁盐：FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、Na₂‑EDTA·2H₂O 37.3mg/L；有机物质：肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸毗哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2.0mg/L。