白僵蚕抗癌活性多糖BBPW-1的分离纯化制备方法

摘要

本发明涉及一种白僵蚕抗癌活性多糖BBPW-1的分离纯化制备方法。白僵蚕粉经丙酮-石油醚回流脱脂和80%乙醇回流除去苷类和生物碱后，用蒸馏水于80~100°C下提取出粗多糖。粗多糖经Sevag法去除蛋白质后，用DEAE琼脂糖凝胶离子交换层析分离出中性多糖组分，再经丙烯葡聚糖凝胶S-300层析，取第1个洗脱峰，减压浓缩后经丙烯葡聚糖凝胶S-500层析进一步纯化，冷冻干燥得到白僵蚕抗癌活性多糖BBPW-1。本发明制备的产物，纯度均一，分子量为3.67×10⁶ Da，对人宫颈癌细胞Hela和人肝癌细胞HepG2的生长均有抑制作用，对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7生长均无不良影响，可用于抗癌产品开发。

主权项

一种白僵蚕抗癌活性多糖BBPW‑1的分离纯化制备方法，其特征在于：1）白僵蚕于‑50℃下真空干燥36 h，于‑15℃下超微粉碎5 min，过80~100目筛，得到白僵蚕粉；2）取白僵蚕粉，按W：V为1:3加入丙酮‑石油醚混合液，丙酮与石油醚体积比为1:1，在60℃下回流脱脂1 h，重复2次，抽滤，残渣用5倍体积质量浓度为80%乙醇在95℃下回流1 h，除去苷类和生物碱，重复3次，抽滤，残渣于40℃烘干；3）烘干残渣按W：V为1：5加入蒸馏水，超声波处理40~50 min后，于80~100℃下提取1~1.5 h，从白僵蚕中提取出粗多糖；4）粗多糖按W：V为1：10加入蒸馏水溶解，用体积比为4:1的氯仿与正丁醇除蛋白6次，碘颜色反应和茚三酮反应均检测不到蛋白质，于50℃下旋蒸以除去氯仿与正丁醇，加入质量浓度为80%乙醇，使乙醇质量浓度达到80%，充分搅拌后置冰箱过夜，沉淀得到多糖；5）多糖用蒸馏水溶解配制成20 mg/mL溶液，8000 rpm 离心10 min，取上清液，过0.45 μm滤膜，上DEAE‑Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，用蒸馏水以3.0~3.5 mL/min流速洗脱，自动收集器收集，苯酚‑硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，减压浓缩，‑50℃下真空干燥，得到中性多糖组分，取名BBPW；6）BBPW用蒸馏水溶解配制成10 mg/mL溶液，过0.45 μm 滤膜，上Sephacryl S‑300 层析柱，用蒸馏水以1.0~1.2 mL/min流速洗脱，自动收集器收集，苯酚‑硫酸法检测，收集第1个洗脱峰的洗脱液，减压浓缩成浓度为10 mg/mL；7）浓缩液上Sephacryl S‑500层析柱，用蒸馏水以1.0~1.2 mL/min流速洗脱，自动收集器收集，苯酚‑硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，‑50℃下真空干燥，得到均一的多糖组分，取名BBPW‑1；8）采用配有TSK PWXL G5000糖分析柱的1525型高效液相色谱系统，以示差和紫外检测器平行检测BBPW‑1，呈现单一对称峰，对照标准曲线计算分子量为3.67×10⁶ Da，为一种高度聚合的大分子多糖；MTT法检测BBPW‑1对人宫颈癌细胞Hela和人肝癌细胞HepG2的生长均表现出明显的抑制作用，在浓度2.5 mg/mL时的抑制率分别为59.1%和50.2%，对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7生长均无不良影响。