一种青蟹眼柄RNA的提取方法

摘要

本发明涉及一种青蟹眼柄RNA的提取方法，以RNAiso Plus试剂为基础，通过在提取过程中RNA悬液中加入1/3悬液量5mol/L醋酸钾后快速离心混合再进行沉淀及采用-70℃条件沉淀RNA，经上述改进后能提取出较好满足实验要求的眼柄部位的RNA。本发明从难以提取的青蟹眼柄组织中提取出RNA，消除沉淀RNA过程中析出的大量乳白色沉淀，得到高质量的RNA，从而克服常规方法提取青蟹眼柄RNA质量不能保证的间题，同时对其他甲壳类生物眼柄组织提取RNA提供了启示，具有良好的应用前景。

主权项

一种青蟹眼柄RNA的提取方法，包括：(1)在液氮中将青蟹标本的眼柄组织研磨成粉末，取部分加入RNAiso Plus试剂后室温静置离心，取上清液；其中，RNAiso Plus试剂的加入量为600μl；(2)在上述上清液中加入1/5上清液体积的氯仿，混匀，室温静置离心，获得水相、蛋白相和氯仿相，取水相；(3)在上述水相中加入1/3水相体积的醋酸钾溶液，室温离心、静置；加入与离心管中液体等体积的异丙醇，混匀，‑70℃静置、室温离心，弃上清液保留沉淀；其中，醋酸钾溶液浓度为5mol/L，用醋酸调节pH至6.0；(4)在上述沉淀中加入乙醇，室温离心，弃上清液保留沉淀；干燥，用DEPC水溶解沉淀，得青蟹眼柄RNA；其中，乙醇浓度为75vol％；DEPC水的加入量为20μl；将所得RNA通过One Step RNA PCR Kit ver 3.0试剂盒，及根据拟穴青蟹管家基因Ubiquitin conjugating enzyme E2及Beta‑actin设计的引物进行逆转录及扩增，再通过琼脂糖电泳验证产物是否为看家基因的目的条带；其中，Ubiquitin conjugating enzyme E2正/反向引物为GGGCAGTGTCGCATTCTATTCCTTC/TGAGAAGGTCCTGAATTCCCA AAAGA；Beta‑actin正/反向引物为CTGATAATCAGTCGATGG AAA ATTCACCAC/TCATCTTTTCGCGGTTGGCCTT。