主权项 |
一种银杏叶片叶绿体蛋白质的提取方法,其特征在于包括以下步骤:(1)银杏叶片经24小时以上暗处理,耗尽淀粉粒;(2)将叶片冰浴下用研钵碾碎,加入提取缓冲液研磨成浆后4层纱布过滤,取滤液,所述提取缓冲液成分为:0.3M山梨醇,1mM MgCl<sub>2</sub>,50mM HEPES/KOH(pH 7.8),2mM EDTA,0.04%巯基乙醇,0.1%PVP;(3)滤液于4℃,1500g离心10min进行沉积得叶绿体沉淀颗粒,并用分离缓冲液悬浮,所述分离缓冲液成分为:0.3M山梨醇,1mM MgCl<sub>2</sub>,50mM HEPES/KOH(pH 7.8),2mM EDTA;(4)Percoll密度梯度液制备:用分离缓冲液分别配制40%和80%Percoll,由上至下分别加入5ml的40%Percol和2.5ml的80%Percoll,形成Percoll密度梯度液;(5)将悬浮的叶绿体颗粒1ml加入到制好的Percoll密度梯度液的顶端,经4℃,6000g离心30min后,在80%和40%Percoll细胞分离液之间的分界面上收集完整叶绿体,并用分离缓冲液清洗两次,分离得到完整的叶绿体颗粒;(6)将蛋白质提取缓冲液加入到所提取的叶绿体颗粒中,室温下漩涡混匀5min,加入等体积的Tris‑平衡酚(pH 8.0),超声波混匀10min;所述蛋白质提取缓冲液成分为:100mMTris,100mM EDTA,50mM硼砂,50mM维生素C,1%Triton X‑100,2%巯基乙醇,30%蔗糖;(7)混合液经4℃,15000g离心15min后,将上层的酚相转移到新离心管中;(8)酚相中加入5倍体积的0.1M醋酸銨溶液,放入‑20℃条件下6小时以上以沉淀蛋白,后经4℃,15000g离心15min得蛋白质颗粒;(9)蛋白质颗粒重新悬浮,用冰冻的甲醇和丙酮各清洗两次,每次清洗均经4℃,15000g离心5min,仔细倒出上清液留沉淀即为高纯度的叶绿体蛋白质;清洗好的蛋白质颗粒空气中干燥待用。 |