重组表达载体pEGFP-DsRed-BP及其在检测哺乳动物细胞内ΦC31整合酶活性中的应用

摘要

本发明属于生物工程和蛋白活性检测技术领域，公开了一种重组表达载体pEGFP-DsRed-BP及其制备方法，该表达载体包含载体骨架pEGFP-C1、反向互补插入的DsRed基因序列、φC31整合酶识别序列attB以及反向互补插入的attP序列。本发明还公开了采用该表达载体检测哺乳动物细胞内φC31整合酶活性的方法，其根据共转染后细胞发出的荧光类型或不同荧光细胞间的比例来定性或定量检测φC31整合酶在哺乳动物细胞中的活性。该方法只需一次转染便能通过荧光蛋白直观地评价φC31整合酶在哺乳动物细胞中的活性，检测方法简便，结果可靠且检测成本较低。

主权项

一种重组表达载体pEGFP‑DsRed‑BP，其包含载体骨架pEGFP‑C1、反向互补插入的DsRed基因序列、φC31整合酶识别序列attB以及反向互补插入的attP序列，其是通过以下步骤制备而来的：(1)依据φC31整合酶特异性催化DNA重组反应的机制和特点，分别合成能够被该酶识别的attB序列和attP反向互补序列；(2)从pDsRed‑monomer‑N1载体中克隆包含完整Kozak序列的全长的DsRed‑monomer基因；(3)以pEGFP‑C1载体为骨架，将attB序列插入到其中的Nhe Ⅰ和Age Ⅰ两酶切位点之间，将attP反向互补序列插入到Pst Ⅰ和BamH Ⅰ两酶切位点之间，将DsRed‑monomer基因的反向互补序列插入到Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ两酶切位点之间，构建成pEGFP‑DsRed‑BP载体。