一种制备蜕膜间充质干细胞的方法

摘要

本发明提供了一种制备蜕膜间充质干细胞的方法，包括使用男性足月胎儿胎盘作为原料，无菌处理胎盘；分离蜕膜组织；鉴定蜕膜组织以及获取蜕膜间充质干细胞是否来自母体组织的鉴定；培养蜕膜间充质干细胞；蜕膜间充质干细胞的冻存；蜕膜间充质干细胞的复苏。本发明的方法具有如下技术特点：采集胎儿为男性的胎盘，获得蜕膜组织后经性别鉴定是否来自母体而没有子体组织的污染；防范细菌污染方法，从采集源头减少污染几率，多次冲洗表面，有效减少污染几率；采用单一酶消化，可精简流程；使用无血清培养基培养减少动物源成分使用，细胞性能稳定，可维持蜕膜间充质干细胞在体外长期培养过程，维持细胞形态、增殖能力、MSC表面标记表达、分化能力等。

主权项

一种制备蜕膜间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）使用分娩排出0～30min 内的男性足月胎儿胎盘作为原料；用胎盘清洗液冲洗胎盘外表1‑3次，将胎盘浸泡于胎盘清洗液中；2）48h内将浸泡在胎盘清洗液中的胎盘运至实验室，取出胎盘，再次用清洗液清洗1‑3次，再从胎盘底部小心分离壁蜕膜，清洗干净后，放入清洗液浸泡0～30min，然后将蜕膜组织剪碎成1～3mm³大小的组织块；3）将蜕膜组织留样进行性别鉴定，确定采集的蜕膜组织单纯来自于母体；4）通过胶原酶消化法从蜕膜组织块获取蜕膜间充质干细胞；5）使用无血清培养基培养蜕膜间充质干细胞，其中P0代蜕膜间充质干细胞长满至80%密度后，使用0.25%胰酶消化，消化时间为3‑5min，P0代之后，细胞在传代操作后48‑72h内进行传代，要求传代时细胞密度80%‑90%，传代后细胞按（3‑8）×10³个/cm²密度接种，培养过程中注意观察培养基PH值变化，一旦变黄添加新鲜培养基并去除培养器皿中等量旧培养基，细胞从P0代传代，传至P1～P30中间的任何一代次；    其中，    所述的步骤1）和步骤2）中的清洗液为0.9%生理盐水；    所述的步骤4）中的胶原酶消化法中所用的胶原酶为终浓度为1‑5mg/ml的胶原酶II；所述的步骤5）中的无血清培养基由以下成分组成：DMEM/F12、PDGF‑BB、 bFGF、(TGF)‑β1、EGF和转铁蛋白Transferrin；其中，PDGF‑BB含量为50～100 ng/mL；bFGF含量为0～50 ng/mL；(TGF)‑β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30 ng/mL；转铁蛋白Transferrin含量为2.0～4.5 mg/mL。