一种表达内切葡聚糖酶的重组大肠杆菌的构建方法

摘要

一种表达内切葡聚糖酶的重组大肠杆菌的构建方法，属于基因工程领域。从超嗜热古菌即掘越氏火球菌中通过PCR扩增得到内切-β-1,4-葡聚糖酶基因SEQIDNo.1，接着去除类SD序列并采用拼接PCR，获得了不包含SD序列内切-β-1,4-葡聚糖酶基因ph1171-sgc-mut-sd,SEQIDNo.2，然后将其插入到大肠杆菌表达载体pET21a中，得到重组载体pET21a-ph1171-sgc-mut-sd,转化大肠杆菌工程菌株E.coliBL21(DE3)plys得到重组菌E.coliBL21(DE3)plys-pET21a-ph1171-sgc-mut-sd。由异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导，上述重组菌得到高效可溶性表达。通过加热变性处理和离心后，经SDS-PAGE检测重组酶纯度达到80%以上。该酶最适反应温度为95℃。该菌株适合用于纺织行业中降解天然结晶纤维素的过程。

主权项

一种表达内切葡聚糖酶的重组大肠杆菌的构建方法，其特征是从超嗜热古菌即掘越氏火球菌Pyrococcus horikoshii (美国菌种保藏中心编号为ATCC700860)中提取基因组DNA为模板，进行PCR扩增，引物：phEG‑SG‑C‑F: 5ˊ‑CAGCAGATCATATGGAAAATACAACATATCAAACACCG‑3ˊphEG‑SG‑C‑R: 5ˊ‑CTCTAAGCGGCCGCTCAAGAACTTTTGGAACAACTATC‑3ˊMut‑SD‑F: 5ˊ‑CGCTTGGTGGGGTGGTAATCTAATG‑3ˊMut‑SD‑R: 5ˊ‑CATTAGATTACCACCCCACCAAGCG‑3ˊPCR扩增体系：在0.5ml PCR管仲按顺序加入以下试剂：10× PCR缓冲液5 µL； dNTPs混合物(每种2.5mM) 1µL；10 µM phEG‑SG‑C‑F 1µL；10 µM phEG‑SG‑C‑R 1µL；基因组DNA 1µL；Vent DNA聚合酶 0.5µL；无菌水40.5 µL；PCR扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性30 s、55℃退火30 s、72 ℃延伸72 s，30个循环；最后72℃延伸5 min; 12℃保温，获得内切‑β‑1，4‑葡聚糖酶基因SEQ ID No:1；以ph1171‑sgc为模板，分别采用phEG‑SG‑C‑F、Mut‑SD‑R和Mut‑SD‑F、phEG‑SG‑C‑R获得不包含类SD序列的ph1171‑sgc的两个部分，之后采用拼接PCR，获得了不包含SD序列的内切‑β‑1，4‑葡聚糖酶基因ph1171‑sgc‑mut‑sd，SEQ ID No:2,该片段经Nde I和Not I双酶切后连入大肠杆菌表达载体pET21a中，获得重组载体pET21‑ph1171‑sgc‑mut‑sd，转化大肠杆菌工程菌株E. coli BL21(DE3) plys得到重组菌E. coli BL21(DE3) plys‑pET21a‑ph1171‑sgc‑mut‑sd。