发明名称 |
一种产低温中性蛋白酶菌株的筛选方法 |
摘要 |
本发明公开了一种产低温中性蛋白酶菌株的筛选方法,本发明的方法通过对培养基改良,在培养基中添加海洋天然物质,对样品浓缩以增加单位体积微生物含量以及控制筛选条件等途径,从我国东海海域约600m水深获得的海洋淤泥中筛选得到产低温中性蛋白酶菌株,最高粗酶酶活达35.5U/ml。 |
申请公布号 |
CN104561238A |
申请公布日期 |
2015.04.29 |
申请号 |
CN201410845331.5 |
申请日期 |
2014.12.31 |
申请人 |
浙江大学 |
发明人 |
钱利纯;闫丰英;张晓旭 |
分类号 |
C12Q1/37(2006.01)I;C12Q1/04(2006.01)I |
主分类号 |
C12Q1/37(2006.01)I |
代理机构 |
杭州求是专利事务所有限公司 33200 |
代理人 |
邱启旺 |
主权项 |
一种产低温中性蛋白酶菌株的筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)制备上清液:将深海淤泥加到质量百分比为0.85%的生理盐水中,深海淤泥和生理盐水的体积比为1:10~20,得到第一悬浮液;漏斗过滤后再使用真空抽滤器过滤,得到的上清液经121℃高温蒸汽灭菌15min;(2)制备初筛培养基、斜面培养基和发酵培养基;以质量比计,初筛培养基中包括2.0%的干酪素和1.5%的琼脂,余量为步骤1制备的上清液,pH为7.0;斜面培养基中包括1.0%的胰蛋白胨、0.5%的酵母膏、1.0%的NaCl和1.5%的琼脂,余量为步骤1制备的上清液,pH为7.0;发酵培养基中包括4.0%的麸皮、0.1%的蛋白胨、0.4%的Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O和0.03%的KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>,余量为步骤1制备的上清液,pH为7.0;(3)菌液浓缩:将深海淤泥加到质量百分比为0.85%的生理盐水中,深海淤泥和生理盐水的体积比为1:5~10,得到第二悬浮液,使用漏斗过滤,得到的上清液置于18~22℃培养箱中培养4~6小时,得到浓缩后的菌液;(4)菌株初筛:将步骤3浓缩后的菌液加到质量百分比为0.85%的无菌生理盐水中,按照10倍梯度稀释法稀释6次,分别取各稀释梯度的菌液置于步骤2制备的初筛培养基中,20~25℃下培养24~72小时;挑取透明圈大的菌株,在步骤2中制备的斜面培养基中保存;(5)菌种复筛:将初筛得到的菌种按体积比1%的接种量接种到发酵培养基中,20℃,200rpm培养48h;得到的发酵液在8000r/min冷冻离心机中4℃离心15min,得到上清液即为粗酶液;以干酪素为底物,用福林酚法测定粗酶液酶活,进一步挑选出产酶能力强的菌株。 |
地址 |
310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号 |