结合叶绿素荧光技术和原生质体系统研究光合作用的方法及其应用

摘要

本发明公开了结合叶绿素荧光技术和原生质体系统研究光合作用的方法及其应用。通过在原生质体中瞬时表达或沉默一个或多个基因，之后利用调制叶绿素荧光成像仪测定拟南芥叶肉细胞原生质体叶绿素荧光变化，并对其图像进行对比，可以快速、高通量地筛选出与光合作用相关的基因。

主权项

一种研究光合作用相关功能基因的方法，包括如下步骤：1)        制备含有叶绿体的原生质体，并将待测基因和/或反义核酸序列转入原生质体并确认待测基因可瞬时表达和/或反义核酸序列已使基因表达瞬时沉默；2)        将转入有待测基因和/或反义核酸序列的原生质体和对照原生质体置于白色不透明孔板中进行暗适应处理；3)        将暗适应处理的原生质体进行光照处理，获取其荧光图像和/或荧光参数，或基于荧光图像和/或荧光参数绘制叶绿素荧光诱导动力学曲线和/或光诱导曲线；4)        对比不同处理组的荧光图像、荧光参数、叶绿素荧光诱导动力学曲线、光诱导曲线中的至少一种，判断待测基因和/或反义核酸序列对光合作用的影响，确定待测基因和/或反义核酸序列沉默的基因是否为光合作用相关基因；其中，含有叶绿体的原生质体的制备方法如下：拟南芥原生质体制备溶液的配制方法母液：①        0.2 M ，pH 5.7 MES ：称取3.9 g MES溶解于100 mL去离子水；②        0.8 M甘露醇：称取29.1 g 甘露醇溶解于200 mL去离子水；③        1 M CaCl₂：称取100 g CaCl₂溶解于100 mL去离子水；④        2 M KCl ：称取14.9 g KCl溶解于100 mL去离子水；⑤        2 M MgCl₂：称取20.33 g MgCl₂溶解于100 mL去离子水；⑥ 10 %BSA：称取1 g BSA溶解于 10 mL去离子水，分装；以上母液均用0.45 µm滤膜过滤除菌，常温保存；酶液：配比为：2 mL 0.2 M pH 5.7的MES，10 mL 0.8 M Mannitol，200 µL 2 M KCl，0.3 g Cellulase R‑10，0.08 g Macerozyme R‑10，7.4 mL ddH₂O，55 ℃加热10 min，冷却到室温，再加入200 µL 1 M CaCl₂，200 µL 10% BSA；混合均匀，用0.45 µm 滤膜过滤得到；W5 溶液：配比为：2 mL 0.2 M pH 5.7 MES，1.8 g NaCl，3.675 g CaCl₂· 2H₂O，0.5 mL2 M KCl，172.5 mL ddH₂O；植物材料为野生型拟南芥Arabidopsis thaliana，ecotype Columbia，（1）培养条件：温度为23 ℃，光强110 µmol·m^‑2·s^‑1，16 h光照，8 h黑暗，相对湿度60%~70%；（2）培养方法：取适量拟南芥种子置于4 ℃冰箱内春化4～5 d后，取出种子，将其点种在灭过菌的营养土上，盖上透明罩培养以缓苗，3 d后揭开罩子，待苗生长三至四周时，方可使用；拟南芥叶肉细胞原生质体的制备选取3～4周龄、充分伸展的叶位为2、3、4对的拟南芥叶片；用刀片将叶片切成0.5~1 mm的细条，放入并浸没在酶液中；将酶液于10 mm汞柱的真空下抽真空30 min，室温黑暗静置酶解3 h；晃动酶液释放原生质体，加入等体积的W5溶液，轻轻晃动平皿，充分释放原生质体；用55 µm的尼龙网过滤原生质体，收集至15 mL圆底塑料试管中，800 rpm离心1~2 min，沉淀的原生质体用预冷的W5溶液清洗一次，之后冰上静置30 min；将待测基因和/或反义核酸序列转入原生质体的方法如下：拟南芥转化主要溶液的配制方法（1）20 mL WI溶液0.4 mL 0.2 M pH 5.7 MES，12.5 mL 0.8 M Mannitol，0.2 mL 2 M KCl                6.9 mL ddH₂O（2）10 mL MMG溶液0.2 mL 0.2 M pH 5.7MES，5 mL 0.8 M Mannitol，0.15 mL 1 M MgCl₂，4.65 mL ddH₂0：（3）10 mL PEG/Ca²⁺溶液4 g PEG 4000，2.5 mL 0.8 M Mannitol，1 mL 1 M CaCl₂，3 mL ddH₂O；拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时转化：a)         MMG溶液重悬原生质体，定量至1～2 × 10⁵个/mL ；b)        在一个2 mL的圆底EP管加入10 µL 含有10～20µg 5 kb大小的质粒DNA，加入100 µL 2 × 10⁴个原生质体，混匀；c)         再加入110 µL PEG/Ca²⁺溶液，混匀；d)        暗处放置15 min后用440 µL W5溶液稀释，并轻轻混匀，800 rpm离心2 min，去上清；e)         加入WI溶液，分散原生质体，平铺于孔板中培养过夜；原生质体叶绿素荧光参数测定采用德国Walz公司的IMAGING‑PAM‑M‑Series叶绿素荧光仪测定原生质体的叶绿素荧光诱导动力学曲线和快速光响应曲线，测定叶绿素荧光诱导动力学曲线时：a)         先将原生质体样品加入孔板，暗适应10 min；b)        打开配套软件，选定感兴趣的区域AOI，所有荧光参数的值都通过软件记录下来；c)         用0.5 µmol·m^‑2·s^‑1的弱光照射测定初始荧光F₀；d)        调制频率为1 Hz， 随后进行2 700 µmol·m^‑2·s^‑1的饱和脉冲光处理，一个脉冲后，得到最大荧光Fm ；e)         打开适合拟南芥原生质体的35 µmol·m^‑2·s^‑1光化光，之后再进行饱和脉冲光处理，一个脉冲后，得到光化光下的最大荧光Fm’。