昆明犬精子体外获能及检测方法

摘要

本发明提出一种昆明犬精子体外获能及检测方法，按以下步骤实现：（1）洗精液及获能液的配制，（2）精液洗涤，（3）体外获能，（4）获能检测，（5）检测诱发顶体反应；本发明在反复试验的基础上，探明了影响昆明犬精子体外获能的关键因素如获能时间、牛血清白蛋白、Ca²⁺、HCO₃^-及其最佳组合，建立了高效的昆明犬精子体外获能体系，将CTC染色及诱发顶体反应结合以检测精子获能情况，结果更加真实可信，为深入研究昆明犬精子获能的分子机理奠定坚实基础。

主权项

昆明犬精子体外获能及检测方法，其特征在于，按以下步骤实现：（1）洗精液mCCM(W)及获能液mCCM的配制按每100ml溶液中含氯化钠0.488g、氯化钾0.0356g、磷酸二氢钾0.0162g、丙酮酸钠0.0028g、乳酸钠浓度60%水溶液0.338ml、葡萄糖0.05g、青霉素G钠盐10000 IU、硫酸链霉素0.005g、酚红0.002g的配方用Milli‑Q超纯水配制洗精液mCCM(W)，经孔径0.22μm滤器过滤后将其于38℃水浴保温；按每100ml溶液中含氯化钠0.488g、氯化钾0.0356g、氯化钙0.0222g、磷酸二氢钾0.0162g、碳酸氢钠0.3159g、丙酮酸钠0.0028g、乳酸钠60%水溶液0.338ml、葡萄糖0.05g、牛血清白蛋白0.3g、青霉素G钠盐10000 IU、硫酸链霉素0.005g、酚红0.002g的配方用Milli‑Q超纯水配制获能液mCCM，经孔径0.22μm滤器过滤后将其置于CO₂培养箱38℃平衡至少2小时；（2）精液洗涤将采集的新鲜精液15ml转至灭菌的离心管中，加入10ml mCCM(W)洗精液，700g离心5min，弃上清，再加10ml mCCM(W)洗精液，700g离心5min洗涤一次，沉淀用适量mCCM(W) 洗精液重悬，使精子浓度为60×10⁶/mL；（3）体外获能将上述洗涤后的精液分至2mL圆底离心管中，每管300μL；每管再加入38℃预热平衡的含2×（CaCl₂、NaHCO₃和BSA）的mCCM 300μL，将离心管置CO₂培养箱于38℃培养3小时；（4）CTC获能检测①、CTC 染液配制：称取CTC 2mg，氯化钠 38mg，半胱氨酸 3mg，Tris缓冲液 12mg，加入5mL Milli‑Q超纯水，用1N NaOH 或1N HCl调pH为7.8；②、染色：避光条件下，在38℃预热的载玻片上加入10μL的CTC染液，再加10μL的步骤（2）所得的精子悬液，10秒钟后加入2μL 12.5%戊二醛Tris溶液，盖上盖玻片，放于湿盒内，4℃避光过夜；取出载玻片，在紫外光下观察，记数，每组总数不少于200个，染色精子分为三种类型：“F”型，为未获能精子，整个精子头部呈较亮的黄绿色；“B”型，为获能但未发生顶体反应的精子，精子的头部顶体区呈黄绿色，而顶体后区较暗；“AR”型，为已发生顶体反应的精子，精子头部后区呈黄绿色，而顶体区变暗；（5） FITC‑PSA检测诱发顶体反应①、向步骤（3）获能3h的精子中加入钙离子载体A23187使其终浓度为10μM，于CO₂培养箱38℃继续培养30min；②、取出孵育的精子50μL，加入1mL Tris缓冲液，700g离心5min, 弃上清；③、沉淀用4℃预冷的1mL无水甲醇于4℃固定30s；④、700g离心5min, 弃上清，加入1mL Tris缓冲液，700g离心5min；⑤、加入FITC‑PSA，使染料浓度为0.05mg/mL，避光孵育20min；⑥、用PBS洗涤一次，吸取10μL于载玻片上，用荧光显微镜观察，计数，每组总数不少于200个；染色精子分为两种类型：顶体完整型：精子顶体区呈绿色，顶体后区变暗；顶体丢失型：精子顶体区和顶体后区无荧光，精子中段有一绿色荧光带。