一种高效表达重组人凝血八因子的方法

摘要

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种利用哺乳动物细胞培养高效表达重组人凝血八因子的工艺方法，具体为将外源的血管性血友病因子添加到表达重组人凝血八因子的细胞培养液中，并在培养过程中控制细胞培养液中血管性血友病因子与人凝血八因子的活性比为1～10:1。本发明利用重组人凝血八因子表达过程中必须要VWF分子伴侣，稳定新生成的人凝血八因子，提高人凝血八因子的累积效果，降低了技术难度，提高了目标蛋白的表达效果。

主权项

一种高效表达重组人凝血八因子的方法，为将外源的血管性血友病因子添加到表达重组人凝血八因子的细胞培养液中，并在培养过程中控制细胞培养液中血管性血友病因子与人凝血八因子的活性比为1～10:1；该方法的具体步骤如下：1)表达细胞的准备：表达人凝血八因子的细胞株的构建或者表达人凝血八因子的冻存细胞的复苏；所述表达人凝血八因子的细胞株或者表达人凝血八因子的冻存细胞为构建的单独表达人凝血八因子的细胞株，并且表达的FVIII包括全长FVIII的和B区有缺失的FVIII片段；2)表达细胞的扩种培养：将步骤1)构建或复苏的人凝血八因子表达细胞接种到无血清培养基中，振荡培养3～4天，至细胞密度达到1～2×10⁶cells/ml，细胞传代，振荡培养扩增至细胞密度达到1～2×10⁶cells/ml，获得种子液；3)细胞反应器培养：将步骤2)获得的种子液接种到细胞反应器的无血清培养基中，培养4～7天，使细胞液的细胞密度达到1～5×10⁶cells/ml；然后向细胞液中加入外源VWF并对细胞液进行补料培养，获得细胞原液；所述补料培养过程中，控制细胞液中VWF活性与FVIII活性比为1～10:1；所述补料培养的条件为：补料培养过程中控制溶氧40～80％，pH 6.8～7.2，搅拌转速40～90转/分钟，培养温度32～38℃，根据葡萄糖的消耗来进行补料，使葡萄糖浓度维持在0.5～1.5g/L；4)凝血八因子产品的制备：对细胞原液进行离心、过滤、纯化处理，获得重组人凝血八因子产品。