一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用

摘要

我们首次将抗性基因sat整合到质粒pMA5上构建出新的具有NTC抗性质粒pMA5-sat。另外，实验室前期筛选获得一株核黄素生产菌Bacillus subtilis RF1，该菌株对多种常规抗生素都有一定的抗性，所以对于该菌株运用质粒表达外源基因的抗性筛选造成了困难。为了验证所构建新型质粒的实用性，首次将来自Bacillus subtilis RF1自身的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf连接抗性质粒pMA5-sat上，得到表达载体pMA5-sat-zwf,将表达载体转化到核黄素生产菌Bacillus subtilis RF1中得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf。多次发酵罐结果表明重组菌发酵60h核黄素产量达到12.01g/L，比原始菌的9.22g/L提高了30.3％。说明新构建的重组质粒pMA5-sat能够用于枯草芽孢杆菌的代谢改造。

主权项

一种新的重组质粒pMA5‑sat，其特征是以上海生工公司合成的sat全基因片段DNA为模板，根据sat基因的特异性设计引物，P1：5’‑ACCGGGATCCATGAAAATTTCGGTGATC‑3’(BamHI)；P2：5’‑GGCACGCGTTTAGGCGTCATCCTGTGCTCC‑3’(MluI)；扩增条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，58℃退火，1min，72℃延伸，30s，35个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环；PCR扩增体系：合成的sat全基因片段DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer5μL，灭菌的双蒸水38μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL，扩增sat基因，大小为525bp；将基因sat连接表达载体pMA5，得到重组质粒pMA5‑sat。