一种DNA病毒基因组的定点改造方法

摘要

本发明提供了一种DNA病毒基因组的定点改造方法，解决了现有技术诱导DNA病毒基因组定点突变困难，插入外源片段操作复杂，重组率较低的问题。将携带有核酸酶系统的质粒转染细胞后，再感染病毒，待细胞出现病变后，收集病变细胞，经冻融或超声处理后再离心，将上清液分离即得到子代病毒。本发明能够实现在筛选病毒减毒疫苗株、构建病毒性基因载体和溶瘤病毒、研究病毒功能序列等的应用，在病毒基因组进行改造过程中，提高诱变效率，精确控制DNA病毒进行基因组定点突变和特定基因敲除，简化外源基因插入DNA病毒载体的操作步骤，提高外源基因整合进入病毒基因组的效率，从而便于进行高通量的重组病毒筛选工作。

主权项

一种DNA病毒基因组的定点改造方法，其特征在于：是通过以下步骤实现的：步骤一，构建定点切割的核酸酶系统：构建包含导向功能的分子和具有核酸酶活性的CRISPR/CAS系统；步骤二，将步骤一的定点切割的核酸酶系统转染细胞，得到转染细胞，其中，控制细胞数量与表达核酸酶系统的质量之间的比例为1×10⁵:0.25‑2μg；步骤三，将经步骤二处理后的细胞培养板的每个孔中加入病毒液，吸附，然后吸去病毒液，再加入细胞维持液，培育至细胞完全病变，得到病变细胞；步骤四，收集步骤三得到的病变细胞和/或上清，冻融或超声处理后，离心去除细胞碎片，所得上清即为子代病毒收获液；步骤五，从步骤四得到的子代病毒收获液中，挑取来源于单克隆的子代病毒，通过核酸测序鉴定，分离出子代病毒；完成DNA病毒基因组的定点改造方法。