一种降解MC-LR的赖氨酸芽孢杆菌原生质体制备与再生的方法

摘要

本发明一种降解MC-LR的赖氨酸芽孢杆菌原生质体制备与再生的方法，涉及生物工程中原生质体制备与再生的方法技术领域。本方法以原生质体融合技术构建工程菌为基础，从已分离的MC-LR高效降解菌T1（Bacillus sphaericus）的原生质体制备。本研究选用灭活原生质体融合法，既减少了工作量，又保证了后续研究中融合子的质量。采用本发明的原生质体制备与再生方法，工艺简单，便于操作，可重复性强；所获得的原生质体制备率最高可达96.64%，且再生率可达83.95%，原生质体制备率高且原生质体活性保持较好，有利于后续融合子的制备与再生。

主权项

一种降解MC‑LR的赖氨酸芽孢杆菌的原生质体制备与再生方法，其特征在于按照下述步骤进行：（1）菌种活化培养：将保藏的球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus）菌株T1重新转接至平板划线分离3次，挑取单菌落接种至新鲜的细菌液体培养基中，置于温度为30℃，转速120 r/min的振荡培养箱中纯培养至对数期，为10⁸‑10⁹个/ml；（2）原生质体的破壁酶解：      取4 ml活化的菌液，4500 r/min离心10 min，收集菌体，经SMM缓冲液洗涤3次，用1.2‑1.8ml的SMM缓冲液重悬；加入0.1‑1 mg/mL的溶菌酶0.2‑0.8ml和2 ml加热至酶解温度的EDTA溶液，在水浴温度35℃条件下酶解0.5‑1.5 h；酶解结束后，3000 r/min离心收集原生质体，用0.55 mol/L的NaCl溶液洗涤3次，洗去酶解液后用4 ml 0.55 mol/L NaCl溶液悬浮即可制备得到原生质体；（3）原生质体的再生：       取上述步骤的原生质体悬浮液，用高渗NaCl溶液稀释到合适的三个梯度，分别吸取200 μl涂布于高渗固体培养基，每个梯度做三个平行，置于30℃恒温培养箱培养48 h，使得原生质体再生；其中步骤（1）中所述的菌种活化培养用的培养基组成如下：（1）细菌培养基：牛肉膏3 g；蛋白胨10 g；NaCl 5 g；蒸馏水1000 mL；pH 7.0‑7.2；若为固体培养基则添加琼脂粉2.4%；上述培养基根据要求在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌20 min；其中所述的菌株T1（Bacillus sphaericus），保藏号为CGMCC NO.4498；其中步骤（3）中所述的原生质体的再生用的高渗固体培养基组成如下：蛋白胨 10 g，酵母浸出汁 5 g，牛肉膏 5 g，蔗糖 170 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.2；若为高渗固体培养基则加入琼脂粉20‑24 g；上述培养基根据要求在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌20 min；其中所述的溶液配制如下：（1）高渗NaCl溶液：NaCl 0.55 mol/L;（2）SMM缓冲液：蔗糖 0.55 mol/L，顺丁烯二酸 20 mmol/L，MgCl₂·6H₂O 20 mmol/L，pH 6.8;（3）EDTA溶液：EDTA 0.8 g/L，SMM缓冲液配制;（4）溶菌酶：0.1‑1 mg/mL，SMM缓冲液配制;上述溶液根据要求在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌20 min。