一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法

摘要

本发明涉及一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法，首先应确定欲修饰的基因数目N，然后将各个基因的CDS区分别引入pOE-1至pOE-N中，同时也可以将每个基因对应的shRNA序列分别引入pSH-1至pSH-N中。通过将pOE-1至pOE-N和pDV-N加入同一个反应体系中，即可一步式构建出N个基因串联过表达的最终质粒；或者将pSH-1至pSH-N和pDV-N加入同一个反应体系中，即可一步式构建出N个基因同时knock-down的最终质粒；同样的，也可以选择其中几个基因的过表达质粒和另外基因的knock-down质粒和pDV-N加入同一个反应体系中，即可一步式构建出既含有多个基因过表达，同时将另一些基因knock-down的最终载体。与现有技术相比，本发明的构建过程一步式，过程简便，效率高，同时可对多个目的基因进行任意组合。

主权项

一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建过表达质粒：1.1)确定欲过表达的基因个数为N；1.2)将欲过表达的N个基因的CDS区按顺序分别插入到N个质粒pOE‑1、pOE‑2直到pOE‑N中，并转化大肠杆菌感受态细胞，过夜培养；1.3)使用定点突变的方法将基因CDS中的BsaI位点进行突变，同时保证其所编码的氨基酸不变；1.4)使用菌落PCR筛选出阳性克隆子并扩增；1.5)分别提取N个质粒；2)构建敲低质粒：2.1)确定欲敲低的基因个数为N；2.2)将欲敲低的N个基因的shRNA oligo按顺序分别引入到N个质粒pSH‑1、pSH‑2直到pSH‑N中，并转化大肠杆菌感受态细胞，过夜培养；2.3)挑选3个克隆子，并测序验证；3)构建过表达和敲低混合质粒：3.1)将欲过表达的基因的CDS或欲敲低的基因的shRNA oligo分别引入pOE质粒和pSH质粒中；3.2)通过测序和菌落PCR验证序列的正确性，并将BsaI位点进行突变；所述的N为大于1的正整数。