重组弧菌抗原OmpK的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方法

摘要

一种重组弧菌抗原OmpK的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方法，属于基因工程领域，它包括(1)克隆噬菌PhiX174溶菌基因与弧菌外膜蛋白OmpK基因(2)构建溶菌质粒载体p-E-OmpK(3)迟缓爱德华菌的转化和筛选(4)菌脱的获得。本发明构建的表达弧菌共同免疫保护抗原OmpK的重组迟缓爱德华菌菌蜕疫苗具有对迟缓爱德华菌和多种致病弧菌的免疫保护效果。

主权项

一种重组弧菌抗原OmpK的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方法_，其特征在于它的步骤如下：(1)克隆噬菌PhiX174溶菌基因与弧菌外膜蛋白OmpK基因,所述的噬菌PhiX174溶菌基因简称E基因，所述的弧菌外膜蛋白OmpK基因简称OmpK基因；(2)构建溶菌质粒载体p‑E‑OmpK根据噬菌体PhiX174溶菌基因和弧菌外膜蛋白OmpK基因序列设计引物，上、下游引物末端分别引入限制性酶切位点EcoRI和BamHI，并在E基因下游引物和OmpK基因上游引物中加上l inker序列；以引物EcoRI‑E‑F、l inker‑E‑R人工合成的E基因为模板进行PCR扩增，以引物l inker‑OmpK‑F、BamHI‑OmpK‑R人工合OmpK基因为模板进行PCR扩增；，回收目的片段，并以纯化后的目的片段为模板，以加l inker的引物进行第二次扩增，将E基因和OmpK基因片段连接到一起，用试剂盒纯化PCR产物得到融合基因片段E‑OmpK；用BamHI和EcoRI双酶切融合基因片段E‑OmpK，经0.8％琼脂糖凝胶电泳后割胶回收各片段，回收后的片段与经相同双酶切并割胶回收的pBV220大片段连接转化Top10感受态细胞，用引物EcoRI‑E‑F/BamHI‑OmpK‑R对转化后培养生长的菌落进行PCR筛选，所得阳性克隆送公司进行测序鉴定正确后，溶菌质粒载体命名为p‑E‑OmpK，并用质粒提取试剂盒提取溶菌质粒载p‑E‑OmpK；所述的E基因上游引物EcoRI‑E‑F：5’GGAATTCATGGTACGCTGGACTTTG‑3’，所述的E基因下游引物l inker‑E‑R：5’‑CTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCTCCTTCTGCACGTA‑3’所述的OmpK基因上游引物l inker‑OmpK‑F：5’GTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCGATTACTCTGACGGCG‑3’所述的OmpK基因下游引物BamHI‑OmpK‑R：5’‑TTAGAACTTGTAAGTTACTG C‑3’；(3)迟缓爱德华菌的转化和筛选按照常规方法制备迟缓爱德华菌感受态细胞，冰浴10min，加入溶菌质粒载体p‑E‑OmpK 10μL，冰浴30min，42℃热休克90s，冰浴1‑2min，加入800μL不含 抗生素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基液体培养基，28℃80～100rpm/min振荡培养45min‑1h，12,000×g离心1min,去上清，剩余40‑50μL上清液重悬沉淀，重悬沉淀后的液体均匀涂布于含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基平板上，28℃培养过夜，得到转化筛选后的含溶菌质粒载体p‑E‑OmpK的迟缓爱德华菌；(4)菌脱的获得将上述步骤转化筛选后的含溶菌质粒载体p‑E‑OmpK的迟缓爱德华菌接种在含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，28℃、180rpm过夜震荡培养，然后按照1：100的体积比转接于含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，28℃震荡培养至所述培养液的吸光值OD₆₀₀nm达0.3‑0.4后进行42℃培养，以诱导E基因和OmpK基因表达，42℃培养诱导5小时后，4000rpm离心4～5分钟收集菌体，用ddH₂O洗菌体沉淀1次、PBS洗三次后收集所剩菌体，即菌蜕，‑20℃冰箱保存备用。